紫檀芪對腦缺血再灌注大鼠的治療作用

龔 亮,賈 衡,王星淇,范月超,盧紅建

1.徐州醫科大學附屬醫院神經外科,徐州 221000;2.南通市第二人民醫院,南通 226006

腦卒中是臨床常見的重癥神經系統疾病,致殘率、復發率、病死率均較高[1]。80%以上的腦卒中為缺血性腦卒中,多發于50歲以上的中老年人群,年新發患者數超過200萬例,且呈現出年輕化的趨勢[2]。目前,臨床對缺血性腦卒中尚無有效治療手段,通常采用纖溶酶原激活劑溶栓配合再灌注治療,但其對患者發病時間窗有嚴格限制,僅能使少數患者獲益,且無法避免后續發生腦缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)損傷[3]。因此,針對缺血性腦卒中,預防性治療的意義更大。紫檀芪是一種分布廣泛的植物抗毒素,化學結構類似白藜蘆醇,且利用率高、合成簡單,具有抗癌、抗炎、抗氧化、抗衰老等多種生物學活性。有學者認為,紫檀芪可保護神經元免受β-淀粉樣蛋白的神經毒性作用、減輕認知功能障礙,從而對老年癡呆小鼠產生治療作用[4]。但關于其對缺血性腦卒中腦保護作用及微血管新生的影響尚未明確,且缺乏對機制的研究。本研究通過建立I/R大鼠模型,觀察紫檀芪對I/R大鼠的治療作用,并探討相關的機制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

E200型顯微鏡(日本Nikon株式會社);ChemiDoc型凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司);DYCZ-25D型電泳儀(北京六一生物科技有限公司);HP300型自動組織脫水機(深圳市達科為醫療科技有限公司);RD-315型石蠟切片機(沈陽源達鑫科技有限公司);E0987型組織包埋機(上海碧云天生物技術有限公司)。

1.2 試藥

紫檀芪(質量分數98%,上海研生實業有限公司);磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatei-dylinositol 3 kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)/糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β,GSK-3β)抑制劑LY294002、Tunel細胞凋亡檢測試劑盒均購自上海谷研實業有限公司;丙二醛(malondialdehyde,MDA)、活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)試劑盒均購自美國Sigma公司;兔抗大鼠CD34、AKT、p-AKT、GSK3β、p-GSK3β一抗均購自美國Chemicon公司。

1.3 動物

SPF級SD大鼠55只,雄性,8周齡,體質量(300±20) g,購自上海靈暢生物科技有限公司,生產許可SCXK(滬)2018-0003。

2 方法

2.1 模型構建

大鼠適應性飼養3 d,用改良Zea Longa線栓法建立腦I/R大鼠模型[5],用戊巴比妥鈉麻醉大鼠,仰臥固定于手術臺上,切開頸部暴露右頸總動脈、外動脈、內動脈,結扎頸總動脈、外動脈近心端,內動脈開口并插入硅膠線栓,造成局灶性缺血,2 h后回抽至開口處恢復血流,抗生素處理后縫合傷口,24 h用Zea Longa評分法評價大鼠神經功能:0分,無異常狀態;1分,左側前爪無法伸展完全;2分,向左側轉圈行走;3分,站立時向左側傾倒;4分,無法站立行走。評分為1～3分視為建模成功。

2.2 分組與干預

參照文獻[6-7]方法,將10只大鼠設為假手術組,剩余45只大鼠隨機分為腦I/R組、紫檀芪組、聯合組,每組15只;術前7 d,聯合組大鼠用紫檀芪(80 mg·kg-1)DMSO溶液灌胃,2 h后腹腔注射LY294002(30 mg·kg-1)DMSO溶液;紫檀芪組大鼠用紫檀芪(80 mg·kg-1)DMSO溶液灌胃,2 h后腹腔注射等體積DMSO;假手術組、腦I/R組大鼠用等體積DMSO灌胃,2 h后腹腔注射等體積DMSO。每日1次,干預7 d。建模后腦I/R組、紫檀芪組各失敗3只,聯合組失敗4只。假手術組大鼠僅暴露頸動脈后縫合。假手術組、腦I/R組、紫檀芪組、聯合組最終分別納入10、12、12、11只大鼠。

2.3 取材方式

確認建模成功的次日,腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉大鼠,采集腹主動脈血,用低溫離心機以2 500 r·min-1離心5 min(離心半徑10 cm),取血清,置于4 ℃冰箱中保存,用于氧化應激指標的檢測;采血后頸椎脫臼處死大鼠,開顱取其完整大腦,切取右側大腦組織,分成2份,一份固定于預冷的質量濃度為40 g·L-1的中性甲醛中24 h,常規脫水、浸蠟、包埋,制成厚4 μm的切片,用于觀察神經元凋亡、微血管新生及病理變化;另一份投入液氮中保存,用于Western blot實驗。

2.4 檢測血清MDA、ROS、SOD水平

取4 ℃冰箱中保存的腹主動脈血清,根據試劑盒說明書進行操作,用比色法檢測血清MDA水平,二氯熒光素法檢測血清ROS水平,細胞色素C還原法檢測血清SOD活性。

2.5 Tunel染色法觀察海馬CA1區神經元凋亡率

取大腦組織切片,常規脫蠟、水洗,根據凋亡檢測試劑盒說明書操作,加入蛋白酶K后,于室溫下靜置20 min,微波高溫修復抗原,冷卻后加入新鮮配置的Tunel反應混合物,移入黑暗濕盒內37 ℃孵育1 min,PBS沖洗,滴加過氧化酶,同環境孵育30 s,PBS沖洗,DAB顯色,蘇木素復染,常規脫水、干燥,中性樹脂封固,于顯微鏡下觀察海馬CA1區神經元凋亡情況,黃褐色細胞即為凋亡神經元,計算凋亡率。凋亡率=(黃褐色細胞數量/總神經元數量)×100%,隨機選取5個不相鄰的均勻視野拍照、統計,取平均值。

2.6 免疫組織化學染色法觀察微血管的新生情況

取大腦組織切片,常規脫蠟,PBS沖洗,移至體積分數為3%的過氧化氫溶液中浸泡12 min,微波高溫修復抗原,冷卻后加入體積分數為5%的胎牛血清封閉20 min,棄血清,加入兔抗大鼠CD34一抗(1∶500),4 ℃孵育過夜,PBS沖洗,加入二抗(1∶2 000),室溫孵育1 h,PBS沖洗,DAB顯色,蘇木素復染,常規脫水、干燥,中性樹脂封固,于顯微鏡下觀察神經微血管密度,以棕黃色單個內皮細胞或細胞群代表1個血管,隨機選取5個不相鄰的密集視野拍照、記錄,平均值即為微血管密度(microvessel density,MVD)。

2.7 HE染色觀察海馬CA1區的病理學改變

取大腦組織切片,常規脫蠟、水化,蘇木素染色5 min,蒸餾水沖洗,加入鹽酸乙醇分化液分化,蒸餾水沖洗,NaHCO3漂洗,伊紅液染色2 min,常規脫水、透明,中性樹脂封固,于顯微鏡下觀察腦組織海馬CA1區的病理變化,并拍照、記錄。

2.8 Western blot法檢測腦組織AKT、p-AKT、GSK3β、p-GSK3β蛋白表達量

取保存于液氮中的腦組織,研磨后加入PBS制成勻漿,加入RIPA裂解液,移至離心管內,置于低溫離心機中以8 000 r·min-1離心12 min(離心半徑15 cm),取上清,用BCA法定量蛋白。取40 μg蛋白樣本,加入4倍體積上樣緩沖液,混合均勻,80 V電壓下進行電泳分離,濕法轉膜,加入體積分數5%的脫脂牛奶封閉2 h,TBST清洗,加入兔抗大鼠AKT、p-AKT、GSK3β、p-GSK3β一抗(1∶500),4 ℃搖床中孵育過夜,TBST清洗,加入二抗(1∶2 000),室溫孵育2 h,ECL發光,暗室顯影,用凝膠成像儀分析蛋白條帶的灰度值。蛋白的相對表達量=蛋白條帶的灰度值/內參GAPDH條帶的灰度值。計算p-AKT/AKT、p-GSK3β/GSK3β。

2.9 統計學方法

3 結果

3.1 神經功能評分比較

與腦I/R組比較,紫檀芪組神經功能評分降低(P<0.05);與紫檀芪組比較,聯合組神經功能評分升高(P<0.05)。結果見表1。

表1 各組大鼠神經功能評分的比較

3.2 血清MDA、ROS、SOD水平比較

與假手術組比較,腦I/R組血清MDA、ROS水平升高,SOD活性降低(P<0.05);與腦I/R組比較,紫檀芪組血清MDA、ROS水平降低,SOD活性升高(P<0.05);與紫檀芪組比較,聯合組血清MDA、ROS水平升高,SOD活性降低(P<0.05)。結果見表2。

表2 各組大鼠血清氧化應激指標MDA、ROS、SOD水平的比較

3.3 海馬CA1區神經元凋亡率比較

假手術組、腦I/R組、紫檀芪組、聯合組海馬CA1區神經元的凋亡率分別為(3.14%±0.57%)、(19.68%±2.46%)、(5.11%±0.77%)、(12.30%±2.39%),與假手術組比較,腦I/R組海馬CA1區神經元的凋亡率升高(P<0.05);與腦I/R組比較,紫檀芪組海馬CA1區神經元的凋亡率降低(P<0.05);與紫檀芪組比較,聯合組海馬CA1區神經元的凋亡率升高(P<0.05)。結果見圖1。

注:A.假手術組;B.腦I/R組;C.紫檀茋組;D.聯合組。

3.4 MVD比較

假手術組、腦I/R組、紫檀芪組、聯合組的MVD分別為(3.00±0.47)、(10.40±3.15)、(22.60±3.42)、(15.20±2.98) 個·mm-2,與假手術組比較,腦I/R組的MVD升高(P<0.05);與腦I/R組比較,紫檀芪組的MVD升高(P<0.05);與紫檀芪組比較,聯合組的MVD降低(P<0.05)。結果見圖2。

注:A.假手術組;B.腦I/R組;C.紫檀茋組;D.聯合組。紅色箭頭指示為新生血管。

3.5 海馬CA1區的病理改變比較

HE染色結果顯示,假手術組神經元排列整齊、結構完整,細胞質染色均勻,細胞核清晰,無水腫,核固縮;模型組神經元排列紊亂、疏松,層次不清,細胞質深染,細胞核固縮且周圍出現空泡;紫檀芪組、聯合組正常神經元數量增加,神經元輪廓清晰、破壞程度減輕,核周圍空泡及核固縮有所改善,其中紫檀芪組病理改變的改善更明顯。結果見圖3。

3.6 腦組織p-AKT/AKT、p-GSK3β/GSK3β比較

與假手術組比較,腦I/R組腦組織p-AKT/AKT、p-GSK3β/GSK3β降低(P<0.05);與腦I/R組比較,紫檀芪組腦組織p-AKT/AKT、p-GSK3β/GSK3β升高(P<0.05);與紫檀芪組比較,聯合組腦組織p-AKT/AKT、p-GSK3β/GSK3β降低(P<0.05)。結果見表3、圖4。

表3 各組大鼠腦組織p-AKT/AKT、p-GSK3β/GSK3β的比較

注:A.假手術組;B.腦I/R組;C.紫檀茋組;D.聯合組。

4 討論

缺血性腦卒中是指部分腦組織因血液循環不暢而發生缺血性壞死的一種急性腦血管疾病,腦部動脈粥樣硬化及由血栓誘發的管腔閉塞、血流量驟減是導致其急性發病的直接原因,血壓不穩、糖尿病、高脂血癥、吸煙、飲酒、不良飲食習慣、強體力活動是導致其發生的主要危險因素[8]。腦組織缺血后因細胞能量代謝障礙而迅速激活缺血級聯反應,導致I/R,可疏通血管、促進神經功能恢復,但將再次損傷腦組織,擴大腦梗死的面積,甚至發展為肺部感染、腎功能衰竭、腦心綜合征、體溫調節障礙等,危及患者生命[9]。I/R損傷是一個多因素反應疊加的過程,與氧自由基激增、鈣離子超載、血腦屏障破壞、炎性因子增多等密切相關,其中氧化應激反應過度被認為是其核心機制之一[10-11]。I/R過程生成大量不同種類的活性氧,氧化-抗氧化平衡被破壞,過量的活性氧引發細胞膜脂質過氧化,血腦通透性增大,同時介導炎性因子生成,促進神經元凋亡,進一步破壞腦組織[12]。

中醫對缺血性腦卒中研究已久,將其歸于“中風”范疇,列為“風、癆、臌、膈”4大病癥之首,認為其主要病機為人過半百、正氣自虛、陰精虧損、肝氣不暢、經脈痹阻、肝火上犯,進而毒侵腦絡、神機失用,發為麻木不仁、張口不閉、神志不清、口眼斜之癥,其本在肝,故治療應以護肝解毒、活血化瘀為主[13]。紫檀是我國名貴中藥,取自豆科植物紫檀干燥心材,性平,味咸,入足厥陰肝經,可解毒、祛瘀、止血,明代醫典《普濟方》記載,紫檀可治大風肌膚不仁、頭而生瘡、顏色腫黑、腹內生蟲、鼻柱崩倒[14]。紫檀芪是一種天然抗氧化劑,最早發現于紫檀中,可清除氧自由基、抑制氧自由基活性,減輕氧化應激損傷[15-16]。LIU J等[17]研究發現,紫檀芪可降低I/R大鼠腦含水量、縮小梗死面積、增加成熟神經元數量、抑制氧化應激反應、緩解I/R損傷,表明紫檀芪具有治療缺血性腦卒中的潛在價值。本研究的結果顯示,與腦I/R組比較,紫檀芪組神經狀態評分,血清MDA、ROS水平,海馬CA1區神經元凋亡率均降低,SOD活性、MVD升高,表明紫檀芪可改善神經功能、抑制氧化應激及神經元凋亡、促進微血管新生。

PI3K/AKT/GSK3β通路是重要的抗凋亡信號通路之一,在細胞增殖、分化、凋亡等活動中扮演重要角色[18]。AKT是一種保守調節激酶,可直接調控下游底物蛋白的濃度,調控細胞活動過程,GSK3β是AKT的下游靶蛋白之一,直接參與調節神經元存活及凋亡過程,PI3K被活化后,將AKT轉移至細胞膜從而磷酸化,p-AKT可轉移至細胞質及細胞核,促進GSK3β轉移及磷酸化失活,降低氧化酶活性,抑制氧化應激反應,從而發揮抑制神經元凋亡、保護腦組織的作用[19-20]。ZHANG Z等[21]研究發現,激活PI3K/AKT/GSK3β通路可以減弱氯胺酮的神經毒性,保護幼鼠海馬組織,抑制神經元凋亡。本研究的結果顯示,與假手術組比較,腦I/R組腦組織p-AKT/AKT、p-GSK3β/GSK3β降低,經紫檀芪干預后均升高,且在紫檀芪基礎上增用PI3K/AKT/GSK3β通路抑制劑LY294002可減弱紫檀芪對I/R大鼠的治療作用,表明PI3K/AKT/GSK3β通路在I/R大鼠中的活性異常降低,紫檀芪可能通過激活該通路對I/R大鼠產生治療作用。

綜上所述,紫檀芪可改善I/R大鼠的神經功能、抑制氧化應激及神經元凋亡、促進微血管新生,推測其作用機制與激活PI3K/AKT/GSK3β信號通路有關。