富平尖柿炭疽病病原菌鑒定及其生物學特性

摘要 為了解引起富平尖柿炭疽病的病原菌種類及其生物學特性，本試驗采集發(fā)生炭疽病的柿樹秋梢，按照稀釋分離法分離病原菌，觀察其形態(tài)學特征，利用真菌通用引物（ITS1/ITS4）和膠孢炭疽菌特異性引物（Cg Int/ITS4）進行分子生物學鑒定，并在PDA培養(yǎng)基上進行孢子萌發(fā)和菌絲生長生物學特性研究，以及通過有傷接種試驗確定病原菌致病性。結(jié)果表明，引起富平尖柿炭疽病的病原菌為刺盤孢屬（Colletotrichum）哈銳炭疽菌（Colletotrichum horii）；哈銳炭疽菌菌絲生長和孢子萌發(fā)最適溫度為25 ℃左右；該病原菌對富平尖柿致病力強，適宜溫度濕度極易引起炭疽病。

關(guān)鍵詞 柿樹；病原鑒定；哈銳炭疽菌；生物學特性

中圖分類號 S436.65 文獻標識碼 A

文章編號 1007-7731（2023）23-24-0128-04

陜西富平柿子栽植歷史悠久，目前柿子種植面積達24 000 hm2，掛果面積達12 000 hm2，年產(chǎn)鮮柿2.8×108 kg，加工柿餅7×107 kg，全產(chǎn)業(yè)鏈產(chǎn)值約65億元。富平柿餅因個大、底亮、霜白、質(zhì)潤和味香甜的品質(zhì)，其市場占有率和知名度不斷提升，柿子產(chǎn)業(yè)已發(fā)展成為當?shù)氐奶厣еa(chǎn)業(yè)。富平尖柿是柿炭疽病菌的易感品種[1-2]，尤其是5年以下樹齡，若管理不當，柿園發(fā)病率可達70%，嚴重時甚至毀園[3-4]。

柿樹炭疽病病原菌有著豐富的形態(tài)學特征，在不同的環(huán)境條件下其表型存在一定的差異，因此單純的形態(tài)學鑒定無法對其進行準確鑒定[5]。通過分子生物學技術(shù)，目前已鑒定出能夠侵染柿樹的炭疽菌有膠孢炭疽復合種（Colletotrichum gloeosporioides species complex）中的膠胞炭疽菌（C. gloeosporioides）、哈銳炭疽菌（C. horii）和暹羅炭疽菌（C. siamense）[6]，尖孢炭疽復合種（C. acutatum species complex）中的尖孢炭疽菌（C. acutatum）[7]，以及博寧炭疽復合種（C. boninense species complex）中的喀斯特炭疽菌（C. Karstii）[8-9]。國內(nèi)報道的柿樹炭疽菌種類主要為膠孢炭疽復合種中的膠胞炭疽菌和哈銳炭疽菌[10-13]。從病原菌的形態(tài)特征上，張敬澤等[14]認為柿炭疽病菌為膠胞炭疽菌，但根據(jù)ITS、EFla和GPDH基因序列，Weir 等[15]則認為是哈銳炭疽菌。目前富平尖柿炭疽菌在分子生物學方面尚未進行相關(guān)鑒定，無法確定其具體種類。

本試驗通過對富平尖柿炭疽病病原菌進行分離，運用形態(tài)學及分子生物學進行菌種鑒定，并對其生物學特性以及致病性進行探究，為富平尖柿炭疽病病原診斷和病害防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

樣品采集于富平縣某村發(fā)生炭疽病的柿樹秋梢。

1.2 儀器與試劑

超凈工作臺（上海力辰科技）、移液器（德國Eppendorf）、測序儀及PCR儀（Applied Biosystems）、DNA電泳槽（北京六一儀器廠）、穩(wěn)壓電泳儀（北京六一儀器廠）、電熱恒溫水槽（上海一恒科學儀器有限公司）、凝膠成像儀（上海復日科技儀器有限公司）、恒溫培養(yǎng)箱及恒溫搖床（太倉市科教器材廠）和Surf系列精密單道可調(diào)移液器（上海生工生物股份有限公司）。

Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒、瓊脂糖BBI、SanPrep柱式DNAJ膠回收試劑盒和DNA Ladder Mix maker均由上海生工生物股份有限公司提供。

1.3 病原菌分離純化

于2022年10月采炭疽病秋梢，參照方中達[16]的方法進行病原菌的分離純化。（1）選取發(fā)病新梢，用消毒剪刀剪取發(fā)病段，放入滅菌空培養(yǎng)皿中，無菌水清洗表面，用75%乙醇消毒2次，無菌水清洗3次，用無菌濾紙吸干組織表面水分。（2）用消毒剪刀剪開發(fā)病組織表層，取內(nèi)部黑色發(fā)病組織置于PDA培養(yǎng)基中，黑暗條件下26 ℃恒溫培養(yǎng)3 d，待組織塊在培養(yǎng)基上長出菌絲后，用無菌接種針挑取菌絲進行分離培養(yǎng)。（3）用無菌水稀釋長有分生孢子的菌體，再經(jīng)滅菌脫脂棉過濾，濾液用無菌水梯度稀釋后涂布，然后挑取單菌落，在PDA培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。（4）重復步驟（3）3次，獲得的純菌株，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 形態(tài)學鑒定

將純化后的菌株接入PDA培養(yǎng)基中，置于26 ℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)5 d，觀察菌落顏色和形態(tài)，取少量菌體于顯微鏡下觀察分生孢子器、分生孢子及附著胞形態(tài)，通過查閱《真菌鑒定手冊》和《植物病原真菌》進行初步鑒定[17]。

1.5 分子生物學鑒定

病原菌總DNA提取按照Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒操作說明。使用病原菌鑒定引物（表1）進行PCR擴增。

PCR擴增程序：95 ℃預變性5 min后，進行30個循環(huán)，每一個循環(huán)包括94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s；循環(huán)結(jié)束后72 ℃延伸10 min，以保證獲得全長產(chǎn)物。1％瓊脂糖電泳，150 V、電泳20 min，觀察結(jié)果。PCR產(chǎn)物電泳條帶切取所需 DNA目標條帶，純化后由上海生工生物股份有限公司測序。將測序得到的序列在NCBI網(wǎng)站進行BLAST相似性比對。

1.6 生物學測定

1.6.1 溫度對菌絲生長的影響 "將直徑為6 mm的菌餅接種到 PDA平板中央，分別于5、10、15、20、25、28、30和35 ℃下培養(yǎng)5 d，每個處理重復3次，測量菌落直徑。

1.6.2 溫度對孢子萌發(fā)的影響 "將直徑為6 mm的菌餅接種到PDA平板中央，25 ℃下培養(yǎng)7 d，刮去菌體，添加滅菌水，用滅菌紗布過濾，制備孢子懸液，吸取100 μL孢子懸液于制好的PDA平板上，均勻涂布，每個處理重復3次，觀察孢子是否萌發(fā)以及萌發(fā)所需時間。

1.7 致病性測定

將純化培養(yǎng)5 d的菌株菌落，配制成105個/mL的孢子懸浮液。采集的新鮮柿樹枝條、葉片和果實用1.5%次氯酸鈉溶液浸泡消毒4～5 min，無菌水沖洗3次，并置于超凈工作臺吹干。枝條、葉片和果實分別進行有傷接種，重復3次，無菌水接種作為對照，黑暗條件下26 ℃恒溫培養(yǎng)7 d。從發(fā)病部位重新分離病原菌，通過觀察菌落及分生孢子形態(tài)特征，與原接種菌株進行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌形態(tài)學鑒定

在PDA培養(yǎng)基上，菌株菌落近圓形，初期為白色，氣生菌絲絨毛狀，隨著菌齡增長，菌落出現(xiàn)同心輪紋，顏色逐漸變深呈灰褐色，背面有少量黑色素沉淀，呈灰黑色到深褐色，見圖1。分生孢子長橢圓形或圓柱形，表面光滑，兩端鈍圓，單孢無色。通過查閱《真菌鑒定手冊》和《植物病原真菌》進行初步鑒定為刺盤孢屬真菌。

2.2 病原菌分子生物學鑒定

通過真菌通用引物（ITS1/ITS4）[18]，擴增出富平尖柿炭疽病菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，大小549 bp，PCR擴增產(chǎn)物電泳圖譜見圖2。另外，利用膠孢炭疽菌特異性引物（Cg Int/ITS4）[19]未擴增出目標序列。將測序后的ITS序列通過NCBI比對，結(jié)果顯示該菌株DNA序列與哈銳炭疽菌（登錄號：MN635649.1）的核苷酸序列同源性為100%，結(jié)合形態(tài)學特征，將供試菌株鑒定為哈銳炭疽菌。

2.3 病原菌生物學鑒定

2.3.1 溫度對菌絲生長的影響 "由圖3可看出，適宜富平尖柿炭疽病菌菌絲生長的溫度范圍是15～25 ℃，菌落平均日增速度在15～25 ℃范圍內(nèi)隨著溫度的升高而增加，15～20 ℃時日生長速度增加較快，20～25 ℃時日生長速度變緩，菌落在25 ℃條件下生長最快；當溫度超過25 ℃時，菌落生長速度迅速下降。通過測定不同溫度下菌落日增速度，表明該病原菌最適生長溫度為25 ℃左右，低于5 ℃或高于35 ℃，菌絲均不能正常生長。

2.3.2 溫度對孢子萌發(fā)的影響 "顯微鏡和肉眼觀察結(jié)果表明，孢子萌發(fā)的溫度范圍是10～30 ℃，最適孢子萌發(fā)溫度為25 ℃左右（表2）。

2.4 致病性鑒定

有傷接種的枝條、葉片和果實均呈現(xiàn)出黑褐色小斑點（圖3），取發(fā)病組織進一步分離病原菌進行培養(yǎng)，均得到與原接種菌株性狀一致的培養(yǎng)物。

3 結(jié)論與討論

炭疽菌屬真菌種類繁多，且其形態(tài)特征易受培養(yǎng)條件影響，因此單純采用形態(tài)學進行種間鑒定較困難[20]，目前多采用形態(tài)學觀察結(jié)合分子生物學進行鑒定。國內(nèi)報道的柿樹炭疽菌種類主要為膠孢炭疽復合種中的膠胞炭疽菌（C. gloeosporioides）和哈銳炭疽菌（C. horii），本研究通過形態(tài)學觀察及利用真菌通用引物（ITS1/ITS4）和膠孢炭疽菌特異性引物（CgInt/ITS4）的分子鑒定，以及回接試驗確定致病性，鑒定出引起富平尖柿炭疽病的病原菌為哈銳炭疽菌（C. horii）。富平尖柿炭疽病菌菌絲在10～35 ℃均可生長，最適生長溫度為25 ℃左右；病菌孢子在10～30 ℃均可萌發(fā)，最適孢子萌發(fā)溫度為25 ℃左右。這也符合柿樹炭疽病在大田夏、秋兩季溫度適宜，一旦雨水充足，就極易在尖柿樹上發(fā)生的特點。

綜上，富平尖柿屬于炭疽病菌的易感品種，該病對富平地區(qū)尖柿產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展造成了一定影響，對病害的診斷及病原菌的鑒定是進行病害防治的前提。下一步，將通過室內(nèi)和田間試驗，篩選出對富平尖柿炭疽病有良好防治效果的藥劑，為尖柿樹的炭疽病防治提供參考。

參考文獻

[1] 馮鎖牢，穆娟. 富平尖柿炭疽病綜合防治技術(shù)[J]. 陜西農(nóng)業(yè)科學，2009，55（6）：244-245.

[2] 黨立勝，陳聯(lián)英，潘高峰. 富平大尖柿炭疽病的發(fā)生與防治技術(shù)試驗報告[J]. 陜西農(nóng)業(yè)科學，2018，64（1）：11-13.

[3] 穆娟. 富平縣柿子產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀與發(fā)展思路[J]. 陜西農(nóng)業(yè)科學，2012，58（4）：188-189.

[4] 路雅斌，程占國，康克功. 富平柿子炭疽病調(diào)查研究[J]. 陜西林業(yè)科技，2015（2）：98-100.

[5] HYDE K D，CAI L，CANNON P F，et al. Colletotrichum-names in current use[J]. Fungal diversity，2009，39：147-182.

[6] CHANG T，HASSAN O，JEON J Y，et al. First report of anthracnose of persimmon （Diospyros kaki L. f.） caused by Colletotrichum siamense in Korea[J]. Plant disease，2018，102（2）：443.

[7] WILLIAMSON S M，SUTTON T B. First report of anthracnose caused by Colletotrichum acutatum on persimmon fruit in the United States[J]. Plant disease，2010，94（5）：634.

[8] WANG J，AI C X，YU X M，et al. First report of Colletotrichum karstii causing anthracnose on persimmon leaves in China[J]. Plant disease，2016，100（2）：532-538

[9] 張童，姚立萍，胡玉慈，等. 甜柿炭疽病病原菌的鑒定及其防治藥劑的篩選[J]. 福建農(nóng)林大學學報（自然科學版），2020，49（5）：589-596.

[10] 張敬澤，徐同，何黎平. 浙江無核柿炭疽病菌鑒定及附著胞形成過程中的核相變化[J]. 菌物學報，2005，24（3）：446-456.

[11] 李明江. 膠孢炭疽菌侵染柿樹的細胞學研究及CGTA1基因的克隆[D]. 杭州：浙江大學，2007.

[12] 張敬澤. 柿樹炭疽病病原菌及其侵染機制研究[D]. 杭州：浙江大學，2005.

[13] 謝柳. 哈銳炭疽菌的分類和侵染特征的研究[D]. 杭州：浙江大學，2010.

[14] 張敬澤，徐同. 柿樹炭疽病菌在越冬枝條上的菌態(tài)及數(shù)量[J]. 植物保護學報，2003，30（4）：437-438.

[15] WEIR B S，JOHNSTON P R. Characterisation and neotypification of Gloeosporium kaki hori as Colletotrichum horii nom. nov[J]. Mycotaxon，2010，111（1）：209-219.

[16] 方中達. 植病研究方法[M]. 3版. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1998.

[17] 王雪菲，李金榮，盧東曉，等. 核桃炭疽病病原菌的分離鑒定[J]. 植物保護學報，2020，47（5）：1161-1162.

[18] WEIR B S，JOHNSTON P R，DAMM U. The Colletotrichum gloeosporioides species complex[J]. Studies in mycology，2012，73（1）：115-180.

[19] MILLS P R，SREENIVASAPRASAD S，BROWN A E. Detection and differentiation of Colletotrichum gloeosporioides isolates using PCR[J]. FEMS microbiology letters，1992，98（1/2/3）：137-143.

[20] HYDE K D，CAi L，MCKENZIE E H C，et al. Colletotrichum：a catalogue of confusion[J]. Fungal diversity，2009，39（1）：1-17.

（責編：何 艷）