基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接探討紅景天干預(yù)血脂異常的作用機(jī)制

李 昕,于宗良,李曉雅,張曉囡,王澤平,劉龍濤

高脂血癥是脂質(zhì)代謝或轉(zhuǎn)運(yùn)異常導(dǎo)致血脂異常升高的代謝紊亂性疾病,以血清中總膽固醇(total cholesterol,TC)、三酰甘油(triglyceride,TG)及低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein-cholesterol,LDL-C)中的一種或幾種高于正常水平為主要臨床特征[1]。高脂血癥是心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)的重要危險(xiǎn)因素[2]。目前主要通過(guò)調(diào)節(jié)生活方式和使用藥物治療高脂血癥,他汀類(lèi)、貝特類(lèi)、煙酸類(lèi)、依折麥布、ω-3多不飽和脂肪酸等藥物較為常用[3],但此類(lèi)藥物需要長(zhǎng)期服用、個(gè)體差異性大,始終是臨床診療中的難點(diǎn)。高脂血癥導(dǎo)致心血管疾病的病理機(jī)制主要為冠狀動(dòng)脈粥樣硬化,來(lái)自遺傳學(xué)、流行病學(xué)和臨床研究等多方面的證據(jù)表明,殘余膽固醇[4-5]和低密度脂蛋白(LDL)[6-7]升高等血脂異常是動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病(atherosclerotic cardiovascular disease,ASCVD)較明確的危險(xiǎn)因素。此外,高脂血癥尚可影響心肌,加重其缺血再灌注損傷,并降低其對(duì)保護(hù)性干預(yù)措施的反應(yīng)[8],由此可見(jiàn),高脂血癥可通過(guò)多種機(jī)制導(dǎo)致心血管疾病的發(fā)生。紅景天是景天科(Crassulaceae)紅景天屬(Rhodiola.L.)的一類(lèi)藥用植物的統(tǒng)稱(chēng),2002年我國(guó)衛(wèi)生部頒布的“關(guān)于進(jìn)一步規(guī)范保健食品原料管理的通知(衛(wèi)法監(jiān)發(fā)〔2002〕51)”中規(guī)定紅景天是可用于保健食品的藥物,深入挖掘紅景天的藥理作用機(jī)制,拓寬其藥用及食用價(jià)值有重要意義。已有研究初步證明紅景天具有突出的降脂作用[9]。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù),構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò),深入探討紅景天干預(yù)高脂血癥的核心成分及作用機(jī)制,為后續(xù)研究提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 紅景天相關(guān)靶點(diǎn)篩選 以紅景天為關(guān)鍵詞,檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)分析平臺(tái)(TCMSP,https://tcmspw.com/news.php)、中藥綜合數(shù)據(jù)庫(kù)(TCMID,http://www.megabionet.org/tcmid/)、中醫(yī)藥百科全書(shū)數(shù)據(jù)庫(kù)(ETCM,http://www.tcmip.cn/ETCM/)、中藥分子機(jī)制生物信息學(xué)分析工具(BATMAN-TCM,http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)、中醫(yī)藥證候關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)庫(kù)(SymMap,http://www.symmap.org/)等,挖掘藥物活性成分?jǐn)?shù)據(jù),并通過(guò)相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行補(bǔ)充,統(tǒng)一在TCMSP平臺(tái)檢索活性成分蛋白質(zhì)靶點(diǎn),根據(jù)已發(fā)表的文獻(xiàn)補(bǔ)充活性成分已知靶點(diǎn),并在UniProt蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org/)對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行規(guī)范。

1.2 高脂血癥相關(guān)靶點(diǎn)篩選 以“hyperlipemia”和“hyperlipidemia”檢索GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/)、在線人類(lèi)孟德?tīng)栠z傳數(shù)據(jù)庫(kù)(OMIM,https://www.omim.org/)、治療靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)(TTD,https://idrblab.org/ttd/)及DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.drugbank.ca/)。合并4個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)靶點(diǎn)后,刪除重復(fù)值,獲得高脂血癥相關(guān)靶點(diǎn)。

1.3 紅景天成分-高脂血癥靶點(diǎn)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用Venny 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/indexhtml)將紅景天中藥物作用靶點(diǎn)與高脂血癥靶點(diǎn)取交集并繪制韋恩圖,得到紅景天成分-高脂血癥共同靶點(diǎn)。將交集靶點(diǎn)提交至String 11.0(https://version-11-0.string-db.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建PPI模型,生物種類(lèi)設(shè)為“Homo sapiens”,最小作用閾值設(shè)定為“highest confidence”(>0.9),偽發(fā)現(xiàn)率(FDR)嚴(yán)格性設(shè)定為“high”(<1%),其余設(shè)置默認(rèn),得到PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.4 紅景天成分-高脂血癥靶點(diǎn)功能與通路的富集分析 將紅景天調(diào)節(jié)高脂血癥的靶點(diǎn)錄入Metascape平臺(tái)(https://metascape.org/gp/index.html),設(shè)置P<0.01,分析其主要的生物學(xué)過(guò)程與代謝通路并進(jìn)行富集分析,通過(guò)Bioinformatics(http://www.bioinformatics.com.cn/)、Omicshare(https://www.omicshare.com/)平臺(tái)實(shí)現(xiàn)可視化。

1.5 紅景天成分-高脂血癥靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 利用Cytoscape 3.7.2構(gòu)建紅景天成分-高脂血癥靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖,利用Cytoscape 3.7.2內(nèi)置工具分析有效成分、靶點(diǎn)和通路的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù),并分析核心靶點(diǎn)及發(fā)揮藥效的主要活性成分。

1.6 分子對(duì)接驗(yàn)證 選取Cytoscape 3.7.2分析結(jié)果度值排名前5位的活性成分和靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。在PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)和PDB(https://www.rcsb.org/search)平臺(tái)獲取小分子配體和蛋白受體,以分辨率高和參考文獻(xiàn)支持為篩選條件。通過(guò)ChemOffice對(duì)小分子配體能量最小化處理,通過(guò)PyMOL對(duì)蛋白配體進(jìn)行移除水分子、小分子配體,AutoDockTools加氫、計(jì)算電荷并設(shè)置為剛性分子。選中所有活性位點(diǎn),通過(guò)AutoDockTools設(shè)置對(duì)接盒子進(jìn)行分子對(duì)接,OpenBabel實(shí)現(xiàn)可視化,最后通過(guò)PLIP平臺(tái)確定結(jié)合位點(diǎn)并可視化處理。

2 結(jié) 果

2.1 紅景天相關(guān)靶點(diǎn)篩選 篩選后共獲得紅景天活性成分20種,作用靶點(diǎn)96個(gè)。

2.2 高脂血癥相關(guān)靶點(diǎn)篩選 合并后刪除重復(fù)值,最終得到1 574個(gè)高脂血癥相關(guān)靶點(diǎn)。

2.3 紅景天成分-高脂血癥靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用Venny 2.1將紅景天活性成分作用靶點(diǎn)與高脂血癥靶點(diǎn)取交集并繪制韋恩圖,得到共同靶點(diǎn)62個(gè),見(jiàn)圖1。通過(guò)String 11.0平臺(tái)構(gòu)建PPI模型,清除游離節(jié)點(diǎn),共形成點(diǎn)62個(gè),邊110條,平均點(diǎn)度值3.55,平均聚類(lèi)系數(shù)0.512。詳見(jiàn)圖2。

圖2 紅景天成分-高脂血癥靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

2.4 紅景天成分-高脂血癥靶點(diǎn)功能與通路的富集分析 基因本體(gene ontology,GO)功能富集分析得到條目1 243個(gè),其中,生物過(guò)程(BP)條目1 131個(gè),細(xì)胞組成(CC)條目29個(gè),分子功能(MF)條目83個(gè),分別占91.0%、2.3%、6.7%。詳見(jiàn)圖3。京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集篩選得到249條信號(hào)通路,提取其中前20條通路。詳見(jiàn)圖4。紅景天成分參與的生物過(guò)程主要包括活性氧代謝過(guò)程、活性氧合成過(guò)程、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性的調(diào)節(jié)過(guò)程、炎癥反應(yīng)等。分子功能主要包括核受體活性、配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性、血紅素結(jié)合、氧化還原酶活性等。參與的相關(guān)通路主要有糖尿病并發(fā)癥中的晚期糖基化產(chǎn)物(AGE)-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)信號(hào)通路、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化、腫瘤壞死因子(TNF)信號(hào)通路、白細(xì)胞介素-17(IL-17)信號(hào)通路、低氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1)信號(hào)通路及核因子-κB(NF-κB)信號(hào)通路等,相關(guān)靶點(diǎn)通路富集結(jié)果前20位見(jiàn)表1。

圖3 紅景天成分調(diào)節(jié)高脂血癥靶點(diǎn)GO分析

圖4 紅景天成分調(diào)節(jié)高脂血癥KEGG分析

表1 紅景天成分調(diào)節(jié)高脂血癥相關(guān)靶點(diǎn)通路

2.5 紅景天成分-高脂血癥靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 通過(guò)Cytoscape 3.7.2構(gòu)建紅景天成分-高脂血癥靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò),見(jiàn)圖5。網(wǎng)絡(luò)分析顯示,山柰酚度值為36,介度為0.215 0,緊密度為0.490 7,預(yù)測(cè)山柰酚可能是紅景天治療高脂血癥的主要活性成分,其次為蘆丁、紫丁香苷,詳見(jiàn)表2。蛋白激酶B1(AKT1)在網(wǎng)絡(luò)中度值為68,介度為0.156 9,緊密度為0.470 1,預(yù)測(cè)AKT1為紅景天治療高脂血癥的最重要靶點(diǎn),RELA、MAPK8、MAPK10、TNF等亦為相對(duì)重要的靶點(diǎn)。詳見(jiàn)表3。

圖5 紅景天成分-高脂血癥靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖

表2 紅景天主要活性成分藥物特征及網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)特征參數(shù)

表3 紅景天主要成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)特征參數(shù)

2.6 分子對(duì)接驗(yàn)證 根據(jù)度值,選取排名前5位的活性成分與靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證,結(jié)合能越低,分子結(jié)合越穩(wěn)定,對(duì)接效果越好,一般認(rèn)為結(jié)合能低于-29.288 kJ/mol提示對(duì)接穩(wěn)定。結(jié)果如圖6所示,蘆丁、山柰酚、紅景天苷與排名前5位的多數(shù)靶點(diǎn)均對(duì)接良好。蘆丁與AKT1結(jié)合能低于-41.840 kJ/mol,為對(duì)接效果最好的活性成分與靶點(diǎn),其次為蘆丁與RELA、山柰酚與RELA,對(duì)接結(jié)合能均低于-37.656 kJ/mol。針對(duì)對(duì)接效果最好的3對(duì)分子-靶點(diǎn)對(duì)接進(jìn)行可視化處理,見(jiàn)圖7,可以看出結(jié)合以疏水鍵的相互作用和氫鍵為主,與在蘆丁與AKT1的對(duì)接中還存在鹽橋,山柰酚與RELA的對(duì)接中存在π堆積作用。

圖6 紅景天活性成分-高脂血癥靶點(diǎn)分子對(duì)接聚類(lèi)熱圖

圖7 紅景天活性成分-高脂血癥靶點(diǎn)分子對(duì)接結(jié)構(gòu)示意圖

3 討 論

血清中TC或LDL-C升高是冠心病和缺血性腦卒中的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一[10],且其暴露時(shí)間和心血管疾病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)之間存在劑量反應(yīng)關(guān)系,來(lái)自Framingham子代隊(duì)列中55歲以下未患冠心病人群的15年隨訪數(shù)據(jù)表明,無(wú)高脂血癥暴露者冠心病發(fā)病率為4.4%,暴露1～10年者為8.1%,暴露11～20年者為16.5%[11]。心血管疾病是導(dǎo)致死亡的首要原因,根據(jù)2017年全球疾病、傷害和風(fēng)險(xiǎn)因素研究(GBD)對(duì)282種死因的統(tǒng)計(jì)報(bào)告,心血管疾病相關(guān)死亡占全因死亡人數(shù)的1/3[12],且這一數(shù)字逐年增加,1990年—2019年,全球心血管疾病相關(guān)死亡人數(shù)由1 210萬(wàn)人增長(zhǎng)至1 860萬(wàn)人[13]。心血管疾病仍然是全球最主要的公共衛(wèi)生問(wèn)題,而高脂血癥的正確干預(yù)對(duì)降低心血管病發(fā)病率,提高心血管病病人生存質(zhì)量有重要意義。因此,越來(lái)越多的臨床研究者將目光投向中醫(yī)藥,探尋更高效、更優(yōu)化的中西醫(yī)聯(lián)合降脂方案。

中醫(yī)學(xué)中高脂血癥無(wú)單獨(dú)病名,一般認(rèn)為其屬于“痰濁”“血瘀”“膏脂”等范疇[14],多由于飲食失節(jié)、先天不足、年高體衰等因素導(dǎo)致臟腑功能失常,氣血津液不能正常輸布,膏脂運(yùn)行受阻,痰濕內(nèi)蘊(yùn),積聚為濁,化為濁毒,發(fā)為高脂血癥。高脂血癥的病位多在肝、脾、腎三臟,病性有本虛標(biāo)實(shí),本虛以脾腎虧虛為主,標(biāo)實(shí)多為肝郁氣滯、痰瘀互結(jié),其中,痰濁與瘀血本身既是病理產(chǎn)物,又是致病因素。

紅景天生長(zhǎng)在高海拔、高寒、強(qiáng)紫外線的環(huán)境之中,被譽(yù)為“西藏人參”。紅景天在中國(guó)境內(nèi)分布有73種,以西藏和四川等地區(qū)的種類(lèi)分布最為豐富[15]。各版《中國(guó)藥典》均將大花紅景天[Rhodiola crenulata(Hook.f.et Thoms.)H.Ohba]作為該藥的基源藥材進(jìn)行收錄。紅景天味甘、苦,性平,歸肺、心經(jīng),具有益氣活血、通脈平喘的功效,對(duì)胸痹心痛、中風(fēng)偏癱、倦怠氣喘等有較好的治療效果,藥典規(guī)定的常用劑量為3～6 g[16]。紅景天作為一種可用于保健食品的藥物,降脂作用突出,具有較佳的應(yīng)用前景。研究顯示,紅景天注射液可顯著改善急性腦梗死病人血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C水平[17]。有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,紅景天苷可以降低LDL-C、TG,延緩動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程[18]。目前針對(duì)紅景天治療高脂血癥的機(jī)制研究較少,需深入研究以探討其降脂作用機(jī)制。

本研究得到紅景天的主要活性成分為山柰酚、蘆丁、紫丁香苷等。在分子對(duì)接驗(yàn)證時(shí)發(fā)現(xiàn),蘆丁、山柰酚、紅景天苷與度值排名前5位的多數(shù)靶點(diǎn)均對(duì)接良好,結(jié)合能在-29.288 kJ/mol以下,其中,以蘆丁與AKT1、蘆丁與RELA、山柰酚與RELA3對(duì)活性成分-靶點(diǎn)的結(jié)合活性最好。

AKT是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,其在細(xì)胞凋亡及細(xì)胞增殖等多種細(xì)胞過(guò)程中均發(fā)揮重要作用。由AKT1基因編碼的AKT1是其主要亞型,可抑制凋亡、促進(jìn)細(xì)胞的存活。在血脂調(diào)節(jié)方面,多項(xiàng)研究表明,AKT1下調(diào)減少巨噬細(xì)胞凋亡,抑制巨噬細(xì)胞對(duì)LDL的攝取,從而發(fā)揮了降低血脂和抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用[19-20]。

由RELA基因編碼的RelA蛋白是參與NF-κB經(jīng)典通路的一類(lèi)DNA結(jié)合蛋白。促炎細(xì)胞因子可引發(fā)NF-κB經(jīng)典通路的活化,通過(guò)細(xì)胞表面受體與抗原受體介導(dǎo)多亞基IκB激酶(IKK)復(fù)合物的活化,導(dǎo)致NF-κB抑制劑蛋白IκBα磷酸化和降解,蛋白酶體降解,進(jìn)而使得由RelA(p65)和p50組成的NF-κB異二聚體被釋放至細(xì)胞核,誘導(dǎo)增殖和抗凋亡基因等各種靶基因的轉(zhuǎn)錄[21],進(jìn)而參與炎癥、細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡等多種過(guò)程的調(diào)節(jié)。研究顯示,NF-κB信號(hào)通路促炎基因的表達(dá)通過(guò)多種機(jī)制,干預(yù)不同細(xì)胞類(lèi)型,促進(jìn)LDL和免疫細(xì)胞在動(dòng)脈壁內(nèi)皮細(xì)胞的沉積[22],與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[23]。RelA蛋白是隸屬于NF-κB經(jīng)典通路的一類(lèi)DNA結(jié)合蛋白,該通路多由促炎細(xì)胞因子啟動(dòng),通過(guò)細(xì)胞表面受體與抗原受體介導(dǎo)IKK復(fù)合物的激活,IKK激活可引起IκB蛋白的磷酸化和降解,進(jìn)而使得由RelA和p50組成的NF-κB異二聚體被釋放至細(xì)胞核,誘導(dǎo)多種靶基因的轉(zhuǎn)錄[21],參與炎癥、細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡等多種過(guò)程的調(diào)節(jié)。NF-κB通路在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。當(dāng)下觀點(diǎn)認(rèn)為,動(dòng)脈粥樣硬化是動(dòng)脈壁的一種以LDL顆粒和免疫細(xì)胞在內(nèi)皮下空間積累為主要特征的進(jìn)行性炎癥性疾病。在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病過(guò)程中,內(nèi)皮細(xì)胞被激活并表達(dá)趨化因子和細(xì)胞黏附分子,使得血液中的單核細(xì)胞被募集至動(dòng)脈內(nèi)膜,并分化成巨噬細(xì)胞,巨噬細(xì)胞在攝取LDL顆粒后,形成富含脂質(zhì)的泡沫細(xì)胞,參與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成。由此可見(jiàn),單核細(xì)胞募集是動(dòng)脈粥樣硬化形成的關(guān)鍵過(guò)程之一,而NF-κB可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子、趨化因子和黏附分子的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)單核細(xì)胞的募集[22],驅(qū)動(dòng)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病[23]。本研究中,作為紅景天主要成分的蘆丁及山柰酚與RELA這一靶點(diǎn)具有較好的對(duì)接活性,表明紅景天可能通過(guò)調(diào)節(jié)NF-κB通路,預(yù)防由高脂血癥到動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。

綜上所述,本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接相結(jié)合的方法,對(duì)紅景天治療高脂血癥的活性成分、關(guān)鍵靶點(diǎn)、信號(hào)通路進(jìn)行篩選,發(fā)現(xiàn)紅景天可能通過(guò)抗炎及調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化與凋亡等方式干預(yù)高脂血癥的發(fā)生、發(fā)展,具有多成分、多靶點(diǎn)、多系統(tǒng)的特點(diǎn)。同時(shí)使用分子對(duì)接技術(shù)對(duì)成分-靶點(diǎn)結(jié)合活性進(jìn)行初步評(píng)估,為紅景天治療高脂血癥作用機(jī)制的進(jìn)一步研究提供了理論依據(jù)。