基于網絡藥理學與分子對接技術探究加味澤瀉湯治療梅尼埃病的作用機制

趙 赫,董云芳,何玉瑤,劉曉慶,侯曉瑩,胡文文,鐘利群

梅尼埃病是一種以發作性眩暈、波動性聽力下降、耳鳴和(或)耳脹悶感為主要臨床表現的內耳疾病[1]。

該病反復發作,遷延難愈,且發病率呈上升趨勢,嚴重影響了正常工作和生活。目前認為內淋巴積水為梅尼埃病的病理學標志物,而內淋巴積水是否為梅尼埃病的病理機制尚存在爭議[2]。該病病因目前尚不明確,研究表明,內淋巴積水的病因多樣,且均有相關的臨床和實驗研究[3]。現階段對梅尼埃病的治療目標是延長發作間期,減少每次發作的持續時間,減輕發作時的癥狀嚴重程度,保存聽力[4]。目前對于該病的治療主要為對癥藥物治療,如使用前庭抑制劑、糖皮質激素、改善循環及利尿等。但長期應用這些藥物不僅會產生一定程度的耐藥性,而且容易引起不良反應[5-7]。中醫學認為梅尼埃病屬于“眩暈病”范疇,根據其臨床表現和特征,其病機主要歸納為痰飲內盛、髓海不足、肝陽上亢、瘀血阻竅等。

加味澤瀉湯中的主要藥物組成是澤瀉、白術、半夏、天麻、陳皮、茯苓、生姜,本團隊在前期的研究中發現加味澤瀉湯聯合西藥敏使朗治療梅尼埃病可明顯改善眩暈和耳鳴的癥狀,優于單用敏使朗[8]。但是加味澤瀉湯治療梅尼埃病的作用靶點及分子機制仍待闡明。網絡藥理學的出現為解決這一問題提供了契機,該學科整合了計算機技術和系統生物學兩大學科,通過對藥物-活性成分-靶點-基因-疾病進行可視化的展現,揭示了藥物多種活性成分與疾病之間存在的可能作用機制。這與中藥多成分、多靶點的作用機制殊途同歸,十分符合中醫學整體觀念和辨證論治的基本原則[9]。本研究基于網絡藥理學方法及分子對接技術探討加味澤瀉湯在治療梅尼埃病過程中的機制,在闡明部分可能的作用機制的同時進一步探討梅尼埃病的發病機制,為該方的臨床應用提供理論支撐。

1 資料與方法

1.1 加味澤瀉湯中活性成分篩選及靶點預測 分別以澤瀉、白術、半夏、天麻、陳皮、茯苓、生姜為檢索詞在TCMSP[10]、TCMID[11]、BATMAN-TCM[12]數據庫中進行檢索,并對所得到的有效成分結果進行去重。然后以口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%、類藥性(drug-likeness,DL)≥0.18作為篩選活性成分的條件[13]。使用TCMSP靶點預測模型對所篩選出的活性成分的作用靶點進行預測,并通過UniProt[14]數據庫對所得到的靶點進行標準化處理,建立加味澤瀉湯有效成分數據庫及有效作用靶點數據庫。

1.2 加味澤瀉湯“藥物-活性成分-靶點”網絡圖的構建 將加味澤瀉湯中的各中藥、活性成分及作用靶點導入到Cytoscape 3.8.2[15]軟件中構建加味澤瀉湯的藥物-活性成分-靶點網絡圖,其中“節點”(node)表示藥物成分或靶點,“邊”(edge)表示藥物-成分-靶點之間的相互作用。使用Cytoscape 3.8.2軟件中的“Analyze Network”功能對節點的“度值”(Degree)進行計算,Degree值排名前5位的靶點被認為是加味澤瀉湯治療梅尼埃病的關鍵靶點。

1.3 梅尼埃病相關靶點的檢索 以“Meniere disease”為關鍵詞,從GeneCards[16]、OMIM[17]、Disgenet[18]、CTD[19]數據庫中獲取梅尼埃病相關的疾病靶點。利用UniProt數據庫對所得到的疾病靶點進行統一規范。利用Venny 2.1在線繪圖軟件將加味澤瀉湯中活性成分的相關靶點和梅尼埃病相關靶點取交集,得到藥物活性成分-疾病共有靶點。

1.4 蛋白質互作(protein-protein interaction,PPI)網絡構建及網絡拓撲學分析 利用Cytoscape 3.8.2軟件的BisoGenet插件構建PPI網絡。將加味澤瀉湯活性成分靶點與梅尼埃病疾病預測靶點分別導入BisoGenet內分別生成藥物活性成分PPI網絡和梅尼埃病疾病靶點PPI網絡。利用CytoNCA插件對所得到的交集網絡中的節點進行相關屬性值計算,挖掘出核心節點。將加味澤瀉湯有效活性成分及加味澤瀉湯-梅尼埃病共有靶點構建網絡并導入Cytoscape軟件中,生成藥物活性成分-疾病靶點網絡圖,并以Degree值(DC)為篩選依據篩選出核心藥物活性成分及核心靶點。

1.5 通路富集分析 Metascape數據庫[20]能夠幫助獲取基因功能和對基因蛋白進行分析和注釋,并可以對所獲得的結果進行可視化處理,從而得到對基因和蛋白質的進一步認識。本研究利用該數據庫進行基因本體(GO)及京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析。

1.6 分子對接 在PubChem數據庫[21]中下載主要化合物的3D結構,利用Open Babel GUI 2.4.0軟件將3D結構SDF文件轉換為MOL2文件。使用Autodock軟件[22]對所得到的MOL2文件進行處理和轉化,生成化合物結構的PDB文件。在PDB數據庫[23]中檢索并下載3個核心蛋白的3D結構,使用Pymol軟件去除蛋白質的水分子和原配體。使用Autodock和Pymol軟件對所獲得的蛋白結構進行分子對接及可視化處理。

2 結 果

2.1 加味澤瀉湯中藥物的活性成分及作用靶點 通過檢索獲得加味澤瀉湯中藥物的所有活性成分共360個,其中,澤瀉46個,白術55個,半夏116個,天麻46個,陳皮63個,茯苓34個,生姜265個。將上述活性成分按照1.1中篩選活性成分的條件進行篩選,共得到加味澤瀉湯中藥物活性成分39個,其中,半夏10個,白術4個,陳皮5個,茯苓6個,生姜4個,天麻5個,澤瀉7個。A1為澤瀉和陳皮共有活性成分,B1為半夏、天麻和生姜的共有活性成分,B2為半夏和生姜的共有活性成分。部分活性成分見表1。

表1 加味澤瀉湯有效成分部分篩選結果

2.2 加味澤瀉湯“活性成分-靶點”網絡構建 利用Cytoscape 3.8.2對加味澤瀉湯活性成分及其作用靶點的關系網絡進行繪制,共獲得183個節點(包含144個靶點和39個活性成分)與510條關系。見圖1。圖中六邊形為藥物活性成分,菱形為靶點,面積代表Degree值大小;BX代表半夏,BZ代表白術,CP代表陳皮,FL代表茯苓,SJ代表生姜,TM代表天麻,ZX代表澤瀉;A1為澤瀉、陳皮所共有,B1為半夏、天麻和生姜所共有,B2為半夏、生姜所共有。

圖1 加味澤瀉湯活性成分-靶點網絡圖

2.3 梅尼埃病相關靶點 檢索GeneCards、OMIM、DisGeNET、CTD疾病數據庫,得到梅尼埃病靶點數分別為110個、543個、69個、7 790個(經篩選后為923個),篩選并去除重復值后得到靶點1 556個。藥物靶點與疾病靶點交集為44個,見表2;并繪制韋恩圖,見圖2。

圖2 藥物靶點和疾病靶點分布韋恩圖

2.4 藥物活性成分-疾病共有靶點網絡的構建 利用Cytoscape 3.8.2對加味澤瀉湯活性成分及藥物-疾病共同靶點的關系網絡進行繪制和分析,共獲得68個節點與208條邊。見圖3。

圖3 藥物活性成分-疾病靶點網絡圖

2.5 加味澤瀉湯治療梅尼埃病的PPI網絡構建與核心靶點篩選 運用Cytoscape 3.8.2軟件分別構建加味澤瀉湯活性成分PPI網絡和梅尼埃病相關靶點PPI網絡。結果顯示:加味澤瀉湯藥物生物活性化合物靶點PPI網絡共有5 158個節點和127 076條邊(見圖4A),梅尼埃病疾病靶點PPI網絡共有11 155個節點和222 408條邊(見圖4B)。對加味澤瀉湯藥物活性成分PPI網絡和梅尼埃病相關靶點PPI網絡中的相同部分進行合并提取并構建新的加味澤瀉湯成分-梅尼埃病相互作用PPI網絡(見圖4C)。然后篩選DC值大于2倍中位數(DC>58)的節點為篩選條件,構建加味澤瀉湯生物活性成分-梅尼埃病相互作用顯著PPI網絡(見圖4D)。最后對顯著交集PPI網絡進行網絡拓撲學屬性值計算后,進行進一步篩選,最終獲得核心PPI網絡關鍵靶點162個(見圖4E)。通過CytoNCA插件計算節點屬性值后分析得出,前列腺素內過氧化物合酶2(PTGS2)、熱休克蛋白 90AA1(HSP90AA1)、腎上腺素能受體β2(ADRB2)為核心靶點中排名前3位的靶點;關鍵有效成分中β-谷甾醇(beta-sitosterol)、柚皮素(naringenin)、薯蕷皂苷元(diosgenin)、川陳皮素(nobiletin)、黃芩素(baicalein)、豆甾醇(stigmasterol)和卡維丁(cavidine)等活性成分較為突出。詳見表3。

圖4 PPI網絡的構建、網絡拓撲學分析及核心靶點篩選

表3 加味澤瀉湯關鍵成分

2.6 加味澤瀉湯治療梅尼埃病通路富集分析及可視化 使用Metascape數據庫對核心靶點進行GO注釋和KEGG通路分析。核心靶點主要分布于細胞質、膜閥、質膜閥、膜微區、內質網腔、線粒體包膜及細胞器外膜等,這些靶基因通過蛋白質同二聚化活性、轉錄輔激活因子結合、蛋白激酶結合、轉錄共調控結合、激酶結合、DNA結合轉錄因子結合、RNA聚合酶Ⅱ特異性 DNA結合轉錄因子結合、蛋白域特異性結合、泛素蛋白連接酶結合及轉錄因子結合等分子功能,參與細胞對化學應激、氧化應激、無機物、活性氧、脂多糖、細菌來源分子以及對金屬離子的反應等生物進程,見圖5。對KEGG富集通路中P值小于0.01的通路進行進一步分析,進一步篩選并繪制通路氣泡圖,見圖6。

圖5 關鍵靶點GO富集分析

圖6 關鍵靶點KEGG通路富集分析

2.7 分子對接 將藥物化合物中突出的活性成分與關鍵靶點PTGS2、熱休克蛋白90α家族A級成員 1(heat shock protein 90 alpha family class a member 1,HSP90AA1)和ADRB2逐一使用Autodock軟件進行分子對接,并使用Pymol進行可視化處理。結合能越低提示預測結合模式越好。具體化合物與核心靶點的結合能數值見表4。對接完成后,使用Pymol軟件對結果進行可視化處理,見圖7。綜上所述,加味澤瀉湯治療梅尼埃病的關鍵活性成分為柚皮素、薯蕷皂苷元、豆甾醇和β-谷甾醇。同時也驗證了PTGS2、HSP90AA1和ADRB2為其核心作用靶點。

表4 分子對接蛋白靶點結合能 單位:kJ/mol

圖7 關鍵成分和靶點的結合模式圖

3 討 論

本研究通過網絡藥理學的研究方法,對加味澤瀉湯治療梅尼埃病的“中藥-活性成分-靶點-疾病”網絡進行了構建。加味澤瀉湯的活性成分中,按照≥2倍Degree值中位數的條件進行篩選后發現,β-谷甾醇、柚皮素、薯蕷皂苷元、川陳皮素、黃芩素、豆甾醇和卡維丁等活性成分較為突出。β-谷甾醇是一種有機化合物,研究表明該物質具有抗炎及抗氧化自由基的作用[24]。一項針對大鼠的動物實驗也表明,β-谷甾醇具有抗氧化作用及抑制炎癥反應的作用[25]。柚皮素是廣泛存在于蕓香科植物中的一種二氫黃酮類化合物[26],該物質具有很強的抗炎和抗氧化作用。有研究發現,柚皮素可以降低白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)基因的表達水平,改善細胞的炎癥反應和細胞凋亡[27]。薯蕷皂苷元是重要的甾族皂苷元,是半合成甾族化合物的重要原料[28]。該物質可以通過抑制T淋巴細胞的激活,減少炎性因子的分泌。有研究表明,薯蕷皂苷元可由一種小的非編碼RNA途徑來調節機體氧化應激和細胞凋亡作用[29-30]。川陳皮素是一種多甲氧基黃酮化合物,目前研究證實該物質具有抑制炎癥反應、抑制腫瘤細胞、保護神經及調節代謝等方面的功能[31-33]。黃芩素是一種存在于中藥黃芩中的黃酮類成分,該物質具有抗氧化應激、抑制炎癥反應、抗病毒以及神經保護作用[34-36]。豆甾醇是植物甾醇的典型代表,目前的研究發現豆甾醇具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎等作用[37]。卡維丁是一種季銨堿類化合物,目前有研究表明該物質具有減少炎癥反應[38]、抑制氧化應激[39]及抗病毒[40]等作用。總之,加味澤瀉湯主要活性成分在治療梅尼埃病時其發揮的功能主要集中在抑制炎癥反應、抗病毒及抗氧化應激方面。梅尼埃病可能的病因之一為自身免疫因素導致由T淋巴細胞介導或自身免疫復合物循環沉積而產生的炎癥反應[3]。且有大量臨床研究發現,在梅尼埃病的急性期和緩解期均可發現典型的炎癥反應特點[41]。在臨床上對于梅尼埃病急性期病人,除使用前庭抑制劑及對癥支持治療外,口服及靜脈給予糖皮質激素抗炎可顯著改善病人的臨床癥狀。但長期使用激素會出現諸多不良反應,且療效下降。此外,病毒感染也是梅尼埃病發病的可能病因之一[3],因此,加味澤瀉湯在治療梅尼埃病時,不僅兼具抗炎和抗病毒作用,且在有效性和安全性方面也得到了驗證[8],可能是除糖皮質激素外更加安全和有效的一種選擇,具有良好的應用前景。

根據加味澤瀉湯活性成分對應靶點、梅尼埃病相關靶點PPI網絡圖繪制韋恩圖,共得到加味澤瀉湯治療梅尼埃病相關靶點44個。利用網絡拓撲學對各相關靶點屬性值進行計算,按照大于Degree值2倍中位數進行篩選后共得到核心靶點排名前3位的是PTGS2、HSP90AA1、ADRB2,可能與梅尼埃病關系較為密切。環氧合酶是花生四烯酸代謝通路中關鍵限速酶,在炎癥過程中表達上調[42]。環氧合酶-2可以催化花生四烯酸產生前列腺素等一系列炎性介質[43],并參與了各種炎性介質的產生和轉化過程[44]。因此,抑制PTGS2可對炎癥反應和氧化還原反應產生抑制作用[45]。HSP90AA1參與免疫應答反應,當體內存在生物致病因子時可以刺激機體細胞產生應激蛋白參與機體的防御功能。有研究表明,HSP90AA1在驗證反應過程中發揮重要作用[46]。ADRB2即β2腎上腺素受體(β2-AR),可介導去甲腎上腺素誘導細胞分泌白細胞介素-10(IL-10),控制炎癥[47],在人體的免疫細胞中存在有大量的ADRB2表達的β2-AR。針對人和鼠的研究發現,當刺激β2-AR時可以激活核苷酸結合寡聚化結構域蛋白2(NOD2)信號,從而增強了T細胞分化以及對炎癥反應的調控[48]。結合上述分析,推測加味澤瀉湯可能是通過抑制炎癥反應途徑發揮治療梅尼埃病的作用。在對核心靶點進行GO注釋分析中發現加味澤瀉湯治療梅尼埃病的作用靶點主要位于細胞膜上,主要與氧化應激反應等通路相關。KEGG富集分析結果表明,加味澤瀉湯治療梅尼埃病主要涉及的通路可能包括乙型肝炎、脂質和動脈粥樣硬化、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染、人類免疫缺陷病毒1型(HIV-1)感染、弓形體病、結核、麻疹、Th17細胞分化、環磷腺苷(cAMP)信號通路、人巨細胞病毒感染、沙門氏菌感染、松弛素信號通路、致病性大腸桿菌感染等。其中,Th17細胞以分泌促炎因子白細胞介素-17(IL-17)為主,同時也分泌TNF-α、IL-6、白細胞介素-21(IL-21)、白細胞介素-22(IL-22)等[49]。IL-17等促炎因子可與相應受體結合,激活包括核因子-κB、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和CAAT區/增強子結合蛋白(C/EBP)等在內的下游途徑,導致抗菌肽、細胞因子和趨化因子的表達,參與炎癥反應[50]。松弛素是由兩條肽鏈組成的多肽類激素,現有研究認為該物質具有抗炎作用[51]。在一項針對炎癥動物模型的研究中發現,松弛素可以通過釋放一氧化氮從而導致肥大細胞釋放組胺減少[52]。此外,松弛素亦能夠減少炎性反應細胞進入受損器官[53-54]。梅尼埃病與炎癥反應密切相關,因此,除上述兩條與炎癥的產生和發展密切相關的信號通路之外,如皰疹病毒感染、HIV-1感染、弓形體病、結核、麻疹、巨細胞病毒感染、沙門氏菌感染及大腸桿菌感染等外源性感染因素刺激人體,導致身體產生相應的炎癥反應過程,這些炎癥反應的產生和在體內的傳播也可以成為導致梅尼埃病發生的誘因。脂質和動脈粥樣硬化從根本上說也是一種慢性炎癥反應,同樣可能存在炎性因子的擴散。cAMP信號通路是最常見的信號通路之一,能夠調節包括代謝、分泌、鈣穩態、肌肉收縮、細胞活動及基因轉錄等多個生理過程。現代藥理學研究亦表明,加味澤瀉湯可以通過改善內耳中耳蝸血管紋細胞中相關蛋白的作用,使內淋巴液的分泌減少而吸收增加,從而起到改善膜迷路水腫的作用[8]。有研究認為,梅尼埃病內淋巴積水產生的原因和水通道蛋白表達功能失調存在關聯性[55]。精氨酸加壓素(AVP)-V2受體(V2R)-cAMP通路被發現是調控水通道蛋白2的主要通路,且在與多種內耳疾病的研究中發現該通路下游的多種作用因素均存在于內耳中[56]。目前建立標準梅尼埃病膜迷路積水豚鼠模型的方法也是基于上述通路[57]。因此,加味澤瀉湯治療梅尼埃病除涉及炎癥通路之外,還可能與通過cAMP調控下游水通道蛋白的功能有關。

澤瀉湯出自醫圣張仲景所著《傷寒雜病論》一書,原文“心下有支飲,其人苦冒眩,澤瀉湯主之”為治療心下支飲所致之冒眩病證,現代多用于治療由于風痰上擾或痰飲內盛所致的眩暈或腦供血不足等證。本研究中加味澤瀉湯為澤瀉湯原方加半夏白術天麻湯合方而成,半夏白術天麻湯亦為治療風痰壅盛證的經典方劑,現代亦多用于治療由于風痰上擾所致的高血壓、高脂血癥、眩暈及腦供血不足等。因此,將兩個主治眩暈病的經典方劑相結合進行了臨床研究,發現對梅尼埃病眩暈具有良好的臨床療效[8]。方中澤瀉利水滲濕,白術燥濕健脾,氣機升降相互協調從而使脾胃健運,水濕自去。茯苓合澤瀉以增強利水滲濕之功,合白術則增強中焦脾胃運化之力;半夏、生姜降逆止嘔,可以顯著改善病人惡心嘔吐的臨床表現,合用陳皮增強化痰之力;天麻平息肝風、平抑肝陽,使風息則痰亦息,肝陽平則眩暈止。諸藥合用,共奏息風化痰止眩之功。

本研究基于網絡藥理學方法分析了加味澤瀉湯可能通過多成分、多靶點和多通路機制治療梅尼埃病,并利用分子對接的方法對這一結果進行了初步驗證。加味澤瀉湯治療梅尼埃病的關鍵成分為β-谷甾醇、柚皮素、薯蕷皂苷元、川陳皮素、黃芩素、豆甾醇和卡維丁等,通過PTGS2、HSP90AA1和ADRB2等核心蛋白靶點發揮調控炎癥反應、氧化應激反應及調控cAMP等方面的機制,減輕內淋巴積水,改善梅尼埃病癥狀。為了進一步提高研究結果的可靠性,后續將進一步進行實驗研究以對本次研究結果進行驗證。