蟠桃丸化裁方對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠血壓的影響>及作用機(jī)制探討

郭曼萍,梅 俊,陳 瑤,徐鳳芹

高血壓是全球發(fā)病率最高的非傳染性疾病之一,是引起心血管疾病、慢性腎病和死亡的重要危險(xiǎn)因素[1]。據(jù)報(bào)道,2012年高血壓病人約占成年人口的29.1%,但只有83%的病人意識(shí)到自身罹患高血壓,其中只有76%接受了藥物治療,然而約一半接受治療者的血壓仍未能得到良好控制[2]。更嚴(yán)重的是,據(jù)推測(cè)到2030年將有2 700萬(wàn)人罹患高血壓[3]。蟠桃丸化裁方源自清代宮廷醫(yī)案所載的蟠桃丸,具有滋陰補(bǔ)腎、填精生髓的功效。陳可冀院士在20世紀(jì)90年代對(duì)該方進(jìn)行化裁用于臨床,治療腎虛、高齡相關(guān)的老年高血壓及認(rèn)知障礙等疾病,取得較滿意療效。因此,本實(shí)驗(yàn)旨在探索蟠桃丸化裁方對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠(SHRs)的降壓效果及其可能機(jī)制,以期為其臨床應(yīng)用和基礎(chǔ)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 12周齡、無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)SHRs 36只,Wistar-Kyoto(WKY)大鼠12只,兩種大鼠均雌雄各半,購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,許可證號(hào):SCXK(京):2016-0006,動(dòng)物合格證號(hào):11400700261047。飼養(yǎng)時(shí)大鼠可自由飲食、飲水,動(dòng)物房提供規(guī)律光照(晝12 h,夜12 h),環(huán)境溫度18～22 ℃,濕度45%～70% 。

1.2 藥物 蟠桃丸化裁方(組成:麥冬、枸杞子、分心木等),由中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院制劑室熬成浸膏。

1.3 主要試劑及儀器 光學(xué)顯微鏡,由日本Olympus公司提供,型號(hào)BX50;無(wú)創(chuàng)鼠尾壓測(cè)量?jī)x,由北京Softron公司提供,型號(hào)BP98AWU;碘[125I]血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)(批號(hào)20140320)、碘[125I] 醛固酮(批號(hào)20140320)的放射免疫試劑盒,由北京北方生物技術(shù)研究所提供;Masson染色試劑盒、蘇木素-伊紅(HE)染液由北京優(yōu)博奧生物科技提供;磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(p-ERK1/2)抗體(批號(hào)4370 S)、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)抗體(批號(hào)4695 S)、磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)抗體(批號(hào)4257 S)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)抗體(批號(hào)4060 S)、蛋白激酶B(Akt)抗體(批號(hào)4691 S)、磷酸化p38絲裂原活化蛋白激酶(p-p38 MAPK)抗體(批號(hào)4511 S)、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)抗體(批號(hào)8690 S)、磷酸化Smad3(p-Smad3)抗體(批號(hào)9520 S)、Smad3抗體(批號(hào)9523 S)、腎素酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)試劑盒(批號(hào)KE 1439)均由美國(guó)CST公司提供;轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)抗體(批號(hào)ab 92486)由英國(guó)Abcam公司提供;磷酸化PI3K(p-PI3K)抗體(批號(hào)YP 0765)由美國(guó)Immuno Way公司提供。

1.4 分組及給藥方法 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d,再隨機(jī)分為WKY對(duì)照組、SHRs模型組和蟠桃丸化裁方低劑量組、高劑量組,每組12只,雌雄各半。給藥11周,WKY對(duì)照組、SHRs模型組予生理鹽水灌胃,蟠桃丸化裁方低劑量組按3.07 g/(kg·d)的藥物濃度灌胃給藥,蟠桃丸化裁方高劑量組按6.14 g/(kg·d)的藥物濃度灌胃給藥。

1.5 觀察指標(biāo)及方法

1.5.1 血壓測(cè)定 選用尾動(dòng)脈無(wú)創(chuàng)性測(cè)壓法[4]測(cè)量大鼠血壓,給藥前測(cè)量初始血壓值,給藥后每周測(cè)量1次,記錄大鼠尾動(dòng)脈的收縮壓、舒張壓值。給藥11周,但血壓只測(cè)到第10周。因在第11周時(shí)進(jìn)行為期5 d的Morris水迷宮實(shí)驗(yàn),未停止給藥,但因進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)時(shí)大鼠已移出SPF飼養(yǎng)場(chǎng)所,測(cè)壓儀器位于動(dòng)物房且不可搬遷,為不破壞SPF屏障系統(tǒng)環(huán)境,故第11周結(jié)束后未再次進(jìn)行尾動(dòng)脈測(cè)壓。固定大鼠,將大鼠尾巴塞進(jìn)加壓尾套中,將尾套放置在大鼠尾根處,打開(kāi)尾動(dòng)脈無(wú)創(chuàng)性測(cè)壓儀,同時(shí)用加熱器加熱鼠尾,等待儀器界面出現(xiàn)平穩(wěn)脈搏后,再點(diǎn)擊加壓按鈕,使尾套中氣囊充氣加壓,待其超過(guò)收縮壓后,將逐漸減壓,隨后儀器界面顯示出收縮壓、舒張壓值。每只大鼠每次間隔1 min后再次測(cè)量,連續(xù)測(cè)量3次,取平均值。

1.5.2 ELISA法檢測(cè)血清腎素 給藥11周后,所有大鼠用10%的水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉,腹主動(dòng)脈真空取血,將來(lái)自每組大鼠的外周血(5 mL)收集于普通肝素涂覆的管中。4 ℃,3 000 r/min,離心15 min獲得血清。根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)量腎素濃度。根據(jù)腎素的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血清中腎素水平。

1.5.3 放射免疫法檢測(cè)血清AngⅡ、醛固酮 收集用于測(cè)定醛固酮、AngⅡ的血液樣品,置入含有蛋白酶抑制劑和乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)的采集管中。4 ℃,3 000 r/min,離心10 min,吸取上層血清,放入-20 ℃冰箱暫時(shí)儲(chǔ)存。送往中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院檢驗(yàn)科,按照放射免疫試劑盒要求,進(jìn)行測(cè)量。

1.5.4 組織學(xué)分析 腹主動(dòng)脈取血后取材,將主動(dòng)脈剝離,生理鹽水清洗,固定于10%福爾馬林中。①HE染色:將主動(dòng)脈進(jìn)行石蠟切片,常規(guī)脫蠟至水,蘇木素染色,清洗,1%鹽酸分化,清洗,伊紅染色液染色,常規(guī)梯度乙醇脫水,用二甲苯透明,中性膠固定,封片,用光學(xué)顯微鏡在200×與400×放大倍數(shù)下進(jìn)行拍片,留圖。②Masson染色:將切片置于復(fù)合Masson染色溶液中5 min;用0.2%乙酸溶液洗滌1 min;用5%磷鎢酸溶液染色5 min;浸入0.2%乙酸溶液中2 min;用亮綠色染色液染色5 min,浸入0.2%乙酸溶液中2次;用95%乙醇分離,在梯度乙醇中脫水,用二甲苯清洗,并用中性膠固定后再進(jìn)行Masson染色。

1.5.5 Western Blot檢測(cè)腦組織中TGF-β1/Smad3、ERK1/2、PI3K/Akt、p38 MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白及磷酸化蛋白的表達(dá) 將適量的蛋白質(zhì)樣品與蛋白緩沖液混合,100 ℃,煮沸5 min,變性后冷卻,加載到十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠上進(jìn)行電泳。轉(zhuǎn)膜,洗滌,封閉,再用一抗(1∶400)浸漬。一抗孵育過(guò)夜,洗滌,二抗孵育2 h?；瘜W(xué)發(fā)光液浸漬,直至清晰條帶出現(xiàn)。收集圖像,采用軟件定量分析結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠給藥前后血壓比較 與WKY對(duì)照組相比,給藥前后SHRs模型組收縮壓、舒張壓明顯升高(P<0.05)。與SHRs模型組相比,給藥10周后蟠桃丸化裁方高劑量組收縮壓及舒張壓均明顯降低(P<0.05)。詳見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠給藥前后血壓比較(±s) 單位:mmHg

2.2 各組大鼠血清腎素、醛固酮、AngⅡ水平比較 給藥后,與SHRs模型組相比,蟠桃丸化裁方低劑量組和高劑量組血清醛固酮水平明顯降低(P<0.05),血清腎素、AngⅡ水平有降低趨勢(shì),但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠給藥后血清腎素、醛固酮、AngⅡ水平比較(±s) 單位:pg/mL

2.3 各組大鼠主動(dòng)脈形態(tài)學(xué)變化

2.3.1 HE染色 鏡下觀察主動(dòng)脈可見(jiàn),與WKY對(duì)照組比較,SHRs模型組的主動(dòng)脈中膜明顯增厚,肌纖維排列紊亂,平滑肌細(xì)胞肥大、增生,內(nèi)膜彎曲的現(xiàn)象更加明顯;與SHRs模型組比較,蟠桃丸化裁方低劑量組、中劑量組的主動(dòng)脈中膜厚度明顯減小,平滑肌細(xì)胞體積減小、數(shù)量減少,內(nèi)膜仍有彎曲現(xiàn)象,但較SHRs模型組明顯改善。詳見(jiàn)圖1。

圖1 HE染色觀察各組大鼠主動(dòng)脈病理結(jié)構(gòu)(×400)

2.3.2 Masson染色 鏡下觀察主動(dòng)脈可見(jiàn),藍(lán)色為膠原纖維,紅色為血管平滑肌細(xì)胞。與對(duì)照組比較,SHRs模型組主動(dòng)脈中膜的藍(lán)染更多,膠原沉積增多;與SHRs模型組比較,蟠桃丸化裁方低劑量組、高劑量組的膠原纖維含量均明顯減少。詳見(jiàn)圖2。

圖2 Masson染色觀察各組大鼠主動(dòng)脈病理結(jié)構(gòu)(×400)

2.4 各組大鼠主動(dòng)脈PI3K/Akt、ERK1/2、p38 MAPK、TGF-β1/Smad3信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較 與SHRs模型組相比,蟠桃丸化裁方高劑量組p-Akt、p-PI3K蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05),p-ERK1/2、p-Smad3蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.01),TGF-β1、Smad3、PI3K、Akt、p-p38 MAPK、p38 MAPK蛋白表達(dá)水平比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)圖3～圖8。

與SHRs模型組比較,＊ P<0.05。

與SHRs模型組比較,＊ P<0.05。

與SHRs模型組比較,＊ P<0.01。

與SHRs模型組比較,＊ P<0.01。

圖6 各組大鼠主動(dòng)脈p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白表達(dá)水平比較

圖8 各組大鼠主動(dòng)脈TGF-β1蛋白表達(dá)水平比較

3 討 論

高血壓與中醫(yī)學(xué)中的眩暈、頭痛、健忘等對(duì)應(yīng)?！秲?nèi)經(jīng)》中記載眩暈的病機(jī)在于“邪中于項(xiàng)”“髓海不足”,同時(shí)指出頭痛的外因在于風(fēng)、熱、濕、寒邪外感,內(nèi)因在于五臟六腑氣血功能失調(diào)[5],因此,高血壓的病機(jī)應(yīng)為邪氣上擾清竅,或肝腎陰虛致腦失所養(yǎng)。蟠桃丸化裁方中枸杞為君藥,補(bǔ)腎滋陰益精,分心木為臣藥,固腎澀精,諸藥合用可改善年老體虛、腎虛所致的諸多癥狀。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,蟠桃丸化裁方一定程度上有調(diào)節(jié)SHRs血壓的作用。HE及Masson染色結(jié)果顯示,蟠桃丸化裁方能改善長(zhǎng)期高血壓狀態(tài)下主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞排列紊亂及彈性膜彎曲的現(xiàn)象,減少主動(dòng)脈膠原纖維生成,減輕SHRs主動(dòng)脈肥厚。因此,長(zhǎng)期高血壓狀態(tài)下,服用蟠桃丸化裁方可對(duì)主動(dòng)脈有保護(hù)作用。

腎素-血管緊張素-醛固酮(RAAS)系統(tǒng)通過(guò)直接作用于外周血管和調(diào)節(jié)自主神經(jīng)系統(tǒng)來(lái)影響心血管穩(wěn)態(tài)[6]。腎素將血管緊張素原轉(zhuǎn)化為血管緊張素Ⅰ(AngⅠ) 后,血管緊張素轉(zhuǎn)換酶催化AngⅠ轉(zhuǎn)化為AngⅡ。AngⅡ引起血管收縮,刺激釋放來(lái)自腎上腺的腎小球區(qū)的醛固酮,進(jìn)而導(dǎo)致鈉離子和水的重吸收并增加血容量,升高血壓[7]。AngⅡ有兩種主要的受體,分別為AngⅡ受體1型(AT1R)和AngⅡ受體2型(AT2R)。RAAS 主要由AngⅡ與細(xì)胞表面AT1R結(jié)合介導(dǎo)發(fā)揮作用,產(chǎn)生收縮血管,促進(jìn)腎上腺皮質(zhì)釋放醛固酮等作用。在血管平滑肌細(xì)胞中,這會(huì)導(dǎo)致三磷酸肌醇介導(dǎo)的血管收縮,從而導(dǎo)致血壓升高[8]。結(jié)果顯示,蟠桃丸化裁方可明顯降低SHRs血清中醛固酮水平(P<0.05),且血清腎素、AngⅡ水平有降低趨勢(shì),提示其對(duì)RAAS系統(tǒng)具有調(diào)節(jié)作用。

有研究提示,高血壓的發(fā)病機(jī)制與PI3K/Akt、ERK1/2、p38 MAPK、TGF-β1/Smad3等信號(hào)通路關(guān)系密切[9-13]。PI3K/Akt信號(hào)通路參與多種生物學(xué)功能,是調(diào)節(jié)細(xì)胞功能(包括存活、生長(zhǎng)和代謝)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中心,并與心臟成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的調(diào)節(jié)直接或間接相關(guān)[14-15]。研究表明,在高血壓病的病理生理過(guò)程中,PI3K/Akt信號(hào)通路功能紊亂起到了關(guān)鍵的作用[16],AngⅡ受體阻滯劑可通過(guò)激活PI3K/Akt途徑降低SHRs的收縮壓[17]。磷酸化激活狀態(tài)的p-PI3K、p-Akt可作為衡量PI3K/Akt信號(hào)通路活化程度的效應(yīng)指標(biāo)[18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,蟠桃丸化裁方高劑量組大鼠主動(dòng)脈p-Akt、p-PI3K蛋白表達(dá)水平明顯升高,提示其可能通過(guò)上調(diào)PI3K/Akt信號(hào)通路發(fā)揮一定的降壓作用。

MAPK分為4個(gè)主要家族:ERK1/2、ERK5、p38 MAPK以及c-Jun N端激酶1和2(JNK1/2)[19]。該激酶家族的所有信號(hào)通路均參與調(diào)節(jié)肥大性重塑[20]。MAPK的激活導(dǎo)致離心性肥大并促進(jìn)心肌細(xì)胞延長(zhǎng)[21-22],而ERK途徑的抑制導(dǎo)致對(duì)壓力超負(fù)荷的肥大反應(yīng)減弱[23]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,蟠桃丸化裁方高劑量組大鼠主動(dòng)脈中p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平明顯降低,提示ERK1/2信號(hào)通路可能參與了蟠桃丸化裁方對(duì)SHRs血壓及主動(dòng)脈重構(gòu)的改善作用。

TGF-β超家族包括TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3亞型,每種都有其獨(dú)特的生物學(xué)功能[24]。TGF-β1被認(rèn)為是心臟、腎臟、肝臟和肺纖維化的關(guān)鍵增殖和纖維化因子,也參與心臟重塑[25]。Smad2和Smad3促進(jìn)TGF-β1介導(dǎo)的組織纖維化,而Smad7是TGF-β1/Smad通路的反向反饋調(diào)節(jié)器,并抑制TGF-β1誘導(dǎo)的纖維化[26]。TGF-β1/Smad3信號(hào)通路是高血壓血管重塑過(guò)程中導(dǎo)致纖維化的主要途徑之一[27-29]。有證據(jù)表明,在成纖維細(xì)胞中,AngⅡ和TGF-β1/Smad3信號(hào)之間存在相互作用[30],下調(diào)TGF-β1/ Smad3可以減輕高血壓并改善血管結(jié)構(gòu)[31]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,蟠桃丸化裁方能夠降低SHRs主動(dòng)脈中p-Smad3蛋白水平,提示蟠桃丸化裁方可通過(guò)TGF-β1/Smad3信號(hào)通路改善SHRs高血壓狀態(tài)下的主動(dòng)脈重構(gòu)。

綜上所述,蟠桃丸化裁方對(duì)SHRs的血壓可能有一定的調(diào)節(jié)作用,能夠改善主動(dòng)脈結(jié)構(gòu),并能降低血清醛固酮水平,同時(shí)可上調(diào)主動(dòng)脈p-PI3K、p-Akt及下調(diào)主動(dòng)脈p-ERK1/2、p-Smad3蛋白表達(dá)水平,提示蟠桃丸化裁方可能通過(guò)調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad3、ERK1/2、PI3K/Akt信號(hào)通路及RAAS系統(tǒng)發(fā)揮調(diào)節(jié)SHRs血壓、改善主動(dòng)脈重構(gòu)的作用。蟠桃丸化裁方來(lái)源于清朝宮廷秘方蟠桃丸,屬于古方新用,即全其古方之旨,合其古方之制,更新古方的功效及應(yīng)用范圍。在蟠桃丸滋陰補(bǔ)腎、填精生髓的功效基礎(chǔ)上,探索蟠桃丸化裁方治療高血壓等腎虛疾病的可能性,為中醫(yī)現(xiàn)代治療高血壓疾病提供了新路徑。