miR-19a-3p靶向上調SOCS3參與急性川崎病病理發展的機制研究

鄭瑞利,楊慧敏,馮迎軍,呂愛婷,王芳潔

川崎病(Kawasaki disease,KD)是一種以全身中小血管炎性病變為主要病理表現的疾病[1]。川崎病好發于0～5歲兒童,且在亞洲發病率較高,是引起患兒冠狀動脈損傷、獲得性心臟病發生及死亡的主要原因[2]。川崎病發病機制及血管炎惡化機制復雜,且不明確[3]。闡明川崎病過程中血管炎性損害的生物學機制,對靶向治療川崎病具有重要意義。近年來,研究發現,川崎病患兒外周血中存在多種微小RNA(microRNA,miRNA)的異常表達,且miRNA在川崎病發病及轉歸過程中扮演重要角色[4],預示miRNA在川崎病靶向治療過程中有潛在的應用價值。臨床報道發現,miR-19a-3p可調控冠狀動脈血管重構,參與冠狀動脈血管內皮細胞損傷過程,且與急性冠脈綜合征發生發展關系密切[5-6]。但miR-19a-3p在川崎病冠狀動脈惡性損傷過程中的調控作用,鮮見報道。細胞因子信號抑制物3(suppressor of cytokine signaling 3,SOCS3)可調控細胞內信號轉導,介導炎性反應、凋亡、免疫反應等多種生物學反應,參與川崎病血管炎性反應、自身免疫性反應、動脈粥樣硬化等疾病的發生發展過程[7]。且已有研究證實,SOCS3與miR-19a-3p之間存在靶向調控作用,預示miR-19a-3p/SOCS3信號軸也可能參與川崎病血管炎性損傷的潛在治療機制[8]。本研究建立川崎病體內外模型,對此進行驗證,以期為川崎病的靶向治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 川崎病患兒納入及排除標準、動物及細胞來源 收集2015年—2019年我院收治確診的30例川崎病患兒的病歷資料。根據病情狀況分組:川崎病患兒組15例,男8例,女7例,年齡(4.3±1.4)歲,體重(26.0±3.2)kg;川崎病康復組(同期入住我院進行治療后處于康復期的兒童)15例,男9例,女6例,年齡(4.2±1.3)歲,體重(25.9±3.0)kg。納入標準:臨床確定為川崎病,未發現器質性疾病,血液相關實驗室檢查無異常。排除急性上呼吸道感染發熱的兒童;另選取同期來我院體檢的健康兒童(正常兒童組)15名,男9名,女6名,年齡(4.1±1.2)歲,體重(26.1±2.9)kg。所有研究對象均抽取清晨空腹外周靜脈血3 mL(置于一次性血清分離膠管中),待血清析出后,在1 000 r/min、10 min條件下取上層血清保存至-80 ℃冰箱待檢測。

健康清潔級BALB/C小鼠(6～8周齡,體質量18～22 g) ,購于中國食品藥品檢定研究院,生產批號:SCXK(京)2019-0017。所有動物于本院動物房中飼養。本研究經我院動物倫理委員會批準同意,批號為IACUC-01(20190823)。實驗嚴格遵循“3R”原則,即減少、優化、替代。人冠狀動脈內皮細胞(HCAEC)購自美國ATCC。

1.1.2 主要試劑及儀器 白色念珠菌水溶物(CAWS)購自四川睿諾賽生物科技有限公司;蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒購自上海茁彩生物科技有限公司;腫瘤壞死因子-α(TNF-α)及白細胞介素-1β(IL-1β)、血管內皮素(ET)、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)等酶聯免疫吸附實驗(ELISA)試劑盒分別購自上海梵態生物科技有限公司、上海心語生物科技有限公司、上海西格生物科技有限公司、美國Abcam公司;SOCS3、Janus酪氨酸蛋白激酶2(JAK2)抗體、信號轉導和轉錄激活因子3(STAT3)、磷酸化STAT3(p-STAT3)、核轉錄因子-κB(NF-κB)、磷酸化NF-κB(p-NF-κB)等抗體均購自美國Abcam公司;光學顯微鏡(型號:Axio-imager.2)購自北京普瑞賽司儀器有限公司等。

1.2 方法

1.2.1 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-qPCR)及蛋白質印跡(Western Blot)法檢測川崎病患兒血清miR-19a-3p、SOCS3 mRNA及蛋白表達 分別取川崎病患兒、川崎病康復患兒、正常健康兒童血清,TRLZOL法提取細胞總RNA后,以RNA為模板,逆轉錄cDNA,以cDNA為模板,行聚合酶鏈式反應(PCR)反應。反應條件如下:70 ℃ 10 min,42 ℃ 60 min,72 ℃ 15 min。用2-△△Ct法計算miR-19a-3p、SOCS3 mRNA相對表達水平,miR-19a-3p以U6為內參、SOCS3 mRNA以β-actin為內參,引物序列由大連寶生物公司合成。詳見表1。

分別取川崎病患兒、川崎病康復患兒、正常健康兒童血清,用蛋白提取試劑盒提取蛋白,雙辛可寧酸(BCA)法檢測蛋白濃度后,取25 μg蛋白進行電泳及轉膜反應,加入一抗SOCS3(1∶500),內參β-actin(1∶800),4 ℃孵育過夜,加入辣根過氧化物酶(HRP)羊抗兔二抗(1∶800),室溫孵育1 h后,采用增強化學發光法顯色,以凝膠成像儀觀察條帶并拍照,以Image-J軟件分析蛋白相對表達水平。

1.2.2 小鼠川崎病模型建立及分組給藥 參照文獻[9]取小鼠經腹腔注射CAWS 80 mg/mL,每只8 mg,連續5 d,構建川崎病小鼠模型,若小鼠出現顫抖、鼻子和嘴巴區域輕微紅腫現象,表明造模成功。共50只小鼠造模成功,隨機分為模型組、si-miR-19a-3p組、ad-SOCS3組、si-NC組、ad-NC組。另隨機選取正常小鼠10只,腹腔注射0.1 mL生理鹽水,作為正常對照組。各組于分組完成后立即開始給藥,si-miR-19a-3p組及si-NC組經尾靜脈注射含miR-19a-3p低表達序列的腺病毒載體溶液及其陰性對照腺病毒溶液(每只25 μmol/L,50 μL);ad-SOCS3組及ad-NC組經尾靜脈注射含SOCS3高表達序列的腺病毒載體溶液及其陰性對照溶劑(每只25 μmol/L,50 μL);模型組及正常對照組經尾靜脈注射等量生理鹽水;各組連續給藥7 d,每日1次。各組小鼠均于給藥期間觀察小鼠毛發、飲食量等基本狀況。各組小鼠處死后,取冠狀動脈組織,參照1.2.1方法,檢測miR-19a-3p、SOCS3 mRNA及蛋白表達變化。

1.2.3 HE染色及免疫組化染色法檢測小鼠冠狀動脈組織形態變化及SOCS3陽性表達水平 處死小鼠,取心臟左右兩支冠狀動脈組織,左支冠狀動脈組織置于-80 ℃冰箱保存備用,右支冠狀動脈組織置于4%多聚甲醛中固定24 h后,浸蠟、包埋后切成5 μm的石蠟切片。取部分石蠟切片,按HE染色試劑盒說明書方法進行染色后,置于顯微鏡下觀察組織形態變化。取剩余石蠟切片,脫蠟、水化及抗原修復后,加入一抗抗體(SOCS3,1∶200)37 ℃孵育2.5 h,加入二抗IgG抗體(1∶500)室溫孵育1 h,蘇木精復染后,于顯微鏡下觀察拍照,用Image J軟件分析單位面積內陽性表達的平均光密度值。

1.2.4 ELISA法檢測TNF-α、IL-1β、ET、iNOS水平 取1.2.3中-80 ℃冰箱保存的冠狀動脈組織,勻漿后取勻漿液,按ELISA試劑盒說明書方法檢測血清炎性因子TNF-α、IL-1β水平和血管內皮損傷標志物ET、iNOS水平。

1.2.5 Western Blot法檢測冠狀動脈組織SOCS3通路下炎癥相關通路蛋白表達 取1.2.3中-80 ℃冰箱保存的冠狀動脈組織,4 ℃解凍、冰上勻漿分離后取勻漿上清液,提取蛋白,BCA法檢測蛋白總濃度后,取50 μg蛋白行電泳和轉膜反應,加入一抗JAK2、p-STAT3、STAT3、p-NF-κB、NF-κB(1∶800),內參β-actin(1∶1 000)抗體,4 ℃孵育過夜,加入羊抗兔HRP二抗(1∶2 000),室溫孵育1.5 h,增強化學發光法及化學發光儀顯色、曝光后,觀察條帶并拍照,以Image-J軟件分析蛋白相對表達水平。

1.2.6 HCAEC細胞培養及分組轉染 取HCAEC細胞系,常規復蘇培養后,取對數期細胞,按4×105個/孔的密度接種于6孔板中,并設置為正常對照組、川崎病組、si-miR-19a-3p組、si-SOCS3組、si-miR-19a-3p+si-SOCS3組、si-NC-1組、si-NC-2組,每組6個復孔。川崎病組參照文獻[10]方法,于HCAEC細胞培養基中加入川崎病病人血清3 mL進行干預培養;正常對照組于培養基中加入正常兒童血清3 mL進行干預培養;si-miR-19a-3p組及si-NC-1組細胞轉染含miR-19a-3p低表達序列的腺病毒載體溶液及陰性對照試劑si-NC-1后,加入川崎病患兒血清3 mL進行干預培養;si-SOCS3組及si-NC-2組細胞轉染含SOCS3低表達序列的腺病毒載體溶液及陰性對照試劑si-NC-2后,加入川崎病患兒血清3 mL進行培養;si-miR-19a-3p+si-SOCS3組同時轉染si-miR-19a-3p及si-SOCS3。各組細胞干預48 h后,參照1.2.1方法,采用RT-qPCR法及Western Blot法檢測miR-19a-3p、SOCS3 mRNA及蛋白表達,以判定轉染效果。

1.2.7 ELISA法檢測細胞上清液炎性因子TNF-α、IL-1β水平 各組細胞干預48 h后,收集各組細胞,3 000 r/min,離心20 min后,取上清液,按ELISA試劑盒說明書檢測TNF-α、IL-1β水平。

1.2.8 流式細胞術檢測細胞凋亡率 各組細胞干預48 h后,收集各組細胞,按膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡試劑盒說明書方法,用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.9 管腔形成試驗檢測管腔形成情況 各組細胞干預48 h后,參照文獻[10]方法,加入50 μL Matrigel膠,于倒置顯微鏡下觀察血管腔形成狀況。

2 結 果

2.1 miR-19a-3p、SOCS3 mRNA及蛋白在川崎病患兒血清中的表達變化 RT-qPCR及Western Blot結果顯示,與正常兒童組相比,川崎病患兒組血清miR-19a-3p表達升高(P<0.05),SOCS3 mRNA及蛋白表達降低(P<0.05)。川崎病康復組兒童血清中miR-19a-3p表達回降并接近正常水平,SOCS3 mRNA及蛋白表達回升并接近正常水平。詳見表2、圖1。

表2 各組miR-19a-3p、SOCS3 mRNA及蛋白表達比較(±s)

圖1 各組血清SOCS3蛋白表達條帶圖

2.2 沉默miR-19a-3p或上調SOCS3表達對川崎病小鼠行為變化及冠狀動脈組織miR-19a-3p、SOCS3 mRNA及蛋白表達的影響 與正常對照組相比,模型組小鼠有3只死亡,出現顫抖、毛發稀疏、體質量降低及飲食活動減少現象,冠狀動脈組織中miR-19a-3p表達升高(P<0.05),SOCS3 mRNA及蛋白表達降低(P<0.05)。與模型組相比,si-miR-19a-3p組及ad-SOCS3組小鼠無死亡,顫抖、毛發稀疏、體質量降低及飲食活動減少現象緩解,冠狀動脈組織SOCS3 mRNA及蛋白表達升高(P<0.05),ad-SOCS3組冠狀動脈組織miR-19a-3p表達無明顯變化(P>0.05)。詳見圖2、表3。

圖2 小鼠冠狀動脈組織SOCS3蛋白表達條帶圖

表3 各組小鼠冠狀動脈組織miR-19a-3p、SOCS3 mRNA及蛋白表達比較(±s)

2.3 沉默miR-19a-3p或上調SOCS3表達對小鼠冠狀動脈病理損傷及SOCS3陽性表達的影響 HE染色顯示,正常對照組小鼠冠狀動脈結構正常,模型組小鼠冠狀動脈血管可見內皮細胞腫脹、粗糙,血管膜增厚,炎性細胞浸潤明顯。免疫組化顯示,正常對照組小鼠冠狀動脈血管內皮細胞中SOCS3呈弱陽性表達,模型組小鼠SOCS3呈強陽性表達。與正常對照組小鼠相比,模型組小鼠冠狀動脈組織內皮細胞腫脹、炎性浸潤等病理損傷嚴重,SOCS3陽性表達降低(P<0.05)。與模型組相比,si-miR-19a-3p組及ad-SOCS3組冠狀動脈組織內皮損傷緩解,SOCS3陽性表達升高(P<0.05)。詳見圖3、表4。

圖3 小鼠冠狀動脈組織HE染色及SOCS3免疫組化染色圖(×200)

表4 各組小鼠冠狀動脈組織SOCS3陽性表達比較(±s) 單位:平均光密度/mm2

2.4 沉默miR-19a-3p或上調SOCS3表達對小鼠冠狀動脈組織TNF-α、IL-1β水平及iNOS、ET陽性表達的影響 與正常對照組相比,模型組小鼠冠狀動脈組織TNF-α、IL-1β、iNOS、ET表達升高(P<0.05)。與模型組相比,si-miR-19a-3p組及ad-SOCS3組小鼠冠狀動脈組織TNF-α、IL-1β、iNOS、ET表達降低(P<0.05)。詳見表5。

表5 各組小鼠冠狀動脈組織TNF-α、IL-1β、iNOS、ET表達比較(±s) 單位:pg/L

2.5 沉默miR-19a-3p或上調SOCS3表達對小鼠冠狀動脈組織JAK2、p-STAT3、STAT3、NF-κB、p-NF-κB蛋白表達的影響 與正常對照組相比,模型組小鼠冠狀動脈組織JAK2、p-STAT3/STAT3、p-NF-κB/NF-κB蛋白表達升高(P<0.05)。與模型組相比,si-miR-19a-3p組及ad-SOCS3組冠狀動脈組織JAK2、p-STAT3/STAT3、p-NF-κB/NF-κB蛋白表達降低(P<0.05)。詳見圖4、表6。

圖4 各組小鼠冠狀動脈組織JAK2、p-STAT3、STAT3、p-NF-κB、NF-κB蛋白表達免疫印跡圖

表6 各組小鼠冠狀動脈組織JAK2、p-STAT3/STAT3、p-NF-κB/NF-κB蛋白表達比較(±s)

2.6 共轉染miR-19a-3p及SOCS3低表達腺病毒對HCAEC細胞凋亡及管腔形成的影響 與正常對照組相比,川崎病組HCAEC細胞凋亡率及管腔形成數量升高(P<0.05)。與川崎病組相比,si-miR-19a-3p組HCAEC細胞凋亡率及管腔形成數量降低(P<0.05),si-SOCS3組HCAEC細胞凋亡率及管腔形成數量進一步升高(P<0.05)。與si-miR-19a-3p組相比,si-miR-19a-3p組+si-SOCS3組HCAEC細胞凋亡率及管腔形成數量升高(P<0.05)。詳見圖5、表7。

圖5 HCAEC細胞流式細胞凋亡圖及管腔形成圖片

表7 各組HCAEC細胞凋亡率及管腔形成比較(±s)

2.7 共轉染miR-19a-3p及SOCS3低表達腺病毒對miR-19a-3p、SOCS3及炎性因子水平的影響 與正常對照組相比,川崎病組HCAEC細胞TNF-α、IL-1β分泌水平、miR-19a-3p表達水平均升高(P<0.05),SOCS3 mRNA及蛋白表達降低(P<0.05)。與川崎病組相比,si-miR-19a-3p組HCAEC細胞TNF-α、IL-1β分泌水平、miR-19a-3p表達均降低(P<0.05),SOCS3 mRNA及蛋白表達降低(P<0.05);si-SOCS3組HCAEC細胞TNF-α、IL-1β分泌水平、miR-19a-3p表達均進一步升高(P<0.05),SOCS3 mRNA及蛋白表達進一步降低(P<0.05)。與si-miR-19a-3p組相比,si-miR-19a-3p+si-SOCS3組HCAEC細胞TNF-α、IL-1β分泌水平、miR-19a-3p表達均升高(P<0.05),SOCS3 mRNA及蛋白表達降低(P<0.05)。詳見圖6、表8。

圖6 各組細胞SOCS3蛋白表達免疫印跡圖

表8 HCAEC細胞miR-19a-3p、SOCS3及炎性因子水平比較(±s)

3 討 論

川崎病血管炎性細胞浸潤、細胞外基質降解、血管彈性纖維降解,引起的冠狀動脈循環障礙、動脈瘤形成,是導致川崎病患兒死亡率升高及冠狀動脈并發癥增加的重要原因[11]。Stock等[12]發現川崎病患兒血清炎性因子TNF-α、IL-1β水平異常高于正常兒童,并認為TNF-α、IL-1β升高是引起川崎病血管基質金屬蛋白酶9(MMP-9)異常活化、血管內膜屏障破壞加快、血管炎癥損傷加重的重要原因。Huang等[13]研究發現,川崎病急性期,促炎因子TNF-α、IL-1β水平升高加重血管炎性損傷后,可誘導血管內皮分泌ET-1及iNOS,引起一氧化氮(NO)大量生成而加重川崎病心腦血管病變的發生及動脈瘤的形成。沈男等[14]研究發現,細菌毒素和病毒均可導致促炎因子產生,且這些細胞因子與川崎病冠狀動脈血管并發癥發生關系密切,提示檢測炎癥及冠狀動脈病理切片可能是判斷川崎病疾病發生發展的關鍵手段。本研究用CAWS誘導建立小鼠川崎病樣冠狀動脈炎[9],發現小鼠出現死亡、血清炎性因子TNF-α及IL-1β水平升高、血管內皮損傷標志物ET、iNOS水平升高,出現冠狀動脈血管內皮細胞腫脹損傷及炎性細胞浸潤等病理損傷,提示造模成功。

川崎病診斷及血管損傷機制除與炎性因子損傷有關外,還與miRNA異常表達有關。大多數miRNA可參與血管生成、分化、凋亡、炎癥等生物學過程,且在川崎病患兒外周血、冠狀動脈血管組織及心肌組織標本中檢測到miR-155、miR-21和miR-31等多種miRNA的異常表達,且大多數miRNA均參與川崎病的轉歸過程[15],提示miRNA在川崎病診斷及治療過程中有潛在的應用價值,調控miRNA表達可能為川崎病的治療提供新的思路。miRNA中的miR-19a-3p與冠狀動脈病變關系密切[5],且miR-19a-3p也可通過調控NF-κB炎癥通路,調控炎癥性疾病及腹主動脈瘤血管平滑肌細胞損傷過程。另外,miR-19a-3p也是參與冠狀動脈粥樣硬化性心臟病發生發展的重要調控因子[6,16]。但miR-19a-3p是否也參與川崎病冠狀動脈血管病變過程鮮見報道。基于miR-19a-3p調控炎癥反應及參與冠脈綜合征疾病的作用,本研究推測miR-19a-3p也可能為參與調控川崎病血管病變的重要調控因子,并在川崎病患兒血清中檢測到miR-19a-3p表達異常高于正常兒童,且隨著川崎病患兒川崎病癥狀的轉歸,miR-19a-3p水平也回降至正常水平,另外川崎病模型小鼠冠狀動脈組織中miR-19a-3p表達也異常升高,而沉默miR-19a-3p表達后,小鼠死亡、炎性反應、冠狀動脈血管炎癥損傷等川崎病癥狀均明顯緩解,提示miR-19a-3p升高可能與川崎病血管炎性損傷關系密切,降低miR-19a-3p表達可緩解川崎病癥狀。

SOCS3是miR-19a-3p的靶標蛋白。有研究證實,SOCS3中的SH2結構域可與靶蛋白的磷酸酪氨酸結合,使JAK2失活并抑制STAT3磷酸化表達,進而抑制組織炎癥損傷[7,17]。Ohashi等[7,17]研究發現,SOCS3低表達可介導免疫炎癥反應、冠狀動脈血管粥樣硬化疾病炎性損傷過程。本研究發現,隨著川崎病患兒轉歸,SOCS3 mRNA及蛋白表達也逐漸回升至正常水平,上調SOCS3表達后,JAK2、p-STAT3、p-NF-κB在冠狀動脈組織中表達降低,川崎病小鼠死亡及冠狀動脈炎癥反應均明顯降低,提示SOCS3低表達介導的炎癥反應激活,可能參與川崎病炎癥損傷過程。本研究還發現,沉默miR-19a-3p表達后,小鼠川崎病癥狀緩解及miR-19a-3p表達降低的同時,SOCS3在冠狀動脈組織內皮細胞中表達升高,JAK2、p-STAT3、p-NF-κB炎癥反應相關蛋白表達降低,提示沉默miR-19a-3p緩解川崎病癥狀的作用可能與上調SOCS3表達、抑制炎癥反應有關。為了進一步驗證這一猜測,本研究用川崎病患兒血清培養HCAEC模擬體外川崎病模型,發現共轉染miR-19a-3p及SOCS3低表達質粒后,下調SOCS3,可逆轉沉默miR-19a-3p對HCAEC細胞發揮的作用。

綜上所述,miR-19a-3p高表達、SOCS3低表達可能參與川崎病血管炎性損傷過程,沉默miR-19a-3p,可靶向上調SOCS3表達,抑制炎癥反應,改善川崎病冠狀動脈血管損傷狀態,這可為川崎病的靶向治療提供一定參考。但川崎病血管炎性損傷涉及多個miRNA,由多條信號通路共同調節,川崎病其他靶向治療機制還有待進一步驗證。