電針聯合跑輪訓練對MCAO模型大鼠海馬BDNF蛋白表達及學習記憶能力的影響

儲小寧,許明軍,楊 坤,柏中喜,黃鈺瀅

腦卒中是全球殘疾相關死亡的第二大原因[1-2]。δ-阿片受體(delta-opioid receptor,DOR)是一種氧敏感蛋白,對缺血和缺氧敏感。腦源性神經營養因子(BDNF)與其高親和力受體原肌球蛋白相關激酶B(tropomyosin-related kinase B,TrkB)的結合已被認為是抗炎途徑之一[3]。BDNF在腦缺血再灌注(I/R)損傷中可能受DOR的調節。針灸可治療血管性癡呆、血管性認知障礙無癡呆、腦卒中后認知障礙(PSCI)和中風[4-6]。電針是一種有效的腦缺血治療方法,并且與抗炎反應有關[7-8]。有氧運動被發現可改善運動功能,防止神經元死亡,并抑制小膠質細胞和星形膠質細胞的早期炎癥[9-10]。跑步機運動是有氧運動的一種,已廣泛應用于腦卒中康復科學的基礎研究。有臨床證據表明,定期運動可改善神經再生并加強神經連接,并且還表明運動可降低患缺血性腦卒中的風險[11-12]。本研究探討電針聯合跑輪訓練對大腦中動脈閉塞(MCAO)模型大鼠海馬BDNF蛋白表達及學習記憶能力的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗大鼠 健康成年雄性SD大鼠,體質量(230±10)g,從上海實驗動物中心獲得,無特定病原體(SPF)級條件下飼養。將大鼠關在籠子里,光照/黑暗循環12 h,相對濕度60%～70%,溫度(22±2)℃。

1.1.2 MCAO模型構建 大腦中動脈缺血/再灌注損傷(MCAO/R)模型是最廣泛使用的模擬腦I/R損傷的動物模型。MCAO/R(90 min/24 h)程序如下:用戊巴比妥[50 mg/kg,腹腔注射(ip)]麻醉大鼠,通過腹中線切口輕輕暴露右頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)和頸內動脈(ICA),將帶有圓形尖端的3-0單絲尼龍縫合線通過ECA插入右側ICA,深度為(18±2) mm。缺血后90 min小心拆線,再灌注24 h。對假手術大鼠進行上述相同的程序,但不插入縫合線。在整個實驗過程中監測直腸溫度并將其保持在(37.0±0.5)℃。

1.1.3 實驗分組 30只無特定病原體級成年雄性SD大鼠,隨機分為3組:對照組(假手術處理,10只)、MCAO模型組(接受MCAO手術,10只)、電針聯合跑輪組(接受MCAO手術并進行電針聯合跑輪訓練治療,10只)。

1.2 實驗方法

1.2.1 電針治療和跑輪訓練 缺血30 min時,電針聯合跑輪組大鼠分別在水溝(GV26)和左側內關(PC6)進行電針刺激90 min。水溝(GV26)和內關(PC6)取穴依據中國實驗針灸研究會(針灸學會)報告的《動物穴位圖》。使用EA儀器(SDZ-V EA,蘇州,中國)以1～2 mA的強度和5/20 Hz的分散密集頻率刺激穴位。電針后大鼠在定位跑輪機(20 m/min速度)每天進行4 km的跑輪運動,持續2周。在假電針組中,針灸針在沒有電刺激的情況下淺表插入相同的穴位。

1.2.2 梗死體積評估和神經缺陷評分 使用2,3,5-三苯基-氯化四氮唑(TTC)方法評估腦梗死體積。在再灌注24 h評估神經功能缺損評分。神經行為評分如下:0分為無缺陷;1分為左前爪不能完全伸展;2分為向左轉圈;3分為向左摔倒;4分為無自主行走,意識水平低下。

1.2.3 免疫熒光染色 使用距前囟0.48～1.00 mm的切片進行免疫熒光染色。使用共聚焦激光掃描顯微鏡(德國Leica TCS SP8 激光掃描共聚焦顯微鏡)在激發波長490 nm(Alexa Fluor 488)、640 nm(Alexa Fluor 647)和360 nm(Hoechst 33258)下放大630倍拍攝圖像。使用Image-Pro Plus 6.0分析系統計數白細胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細胞介素-10(IL-10)雙陽性細胞,雙陽性細胞的平均百分比表示為雙陽性細胞/總細胞×100%。

1.2.4 蛋白質印跡 將膜在含有0.1% Tween-20的Tris緩沖液(TBST)中用5%脫脂牛奶在室溫下封閉1 h,4 ℃下與一抗一起孵育過夜。TBST洗膜3次,每次10 min,并與相應的辣根過氧化物偶聯二抗在室溫下孵育2 h。使用增強化學發光試劑檢測免疫反應條帶,分析灰度值。

1.2.5 RNA分離和聚合酶鏈式反應(PCR) 將每個樣本的量化值歸一化為同一樣本中的β-肌動蛋白表達,與靶基因同時擴增。使用2-△△Ct方法對相對基因表達進行量化。每個樣品一式3份進行測試。

1.2.6 Morris水迷宮測試 采用類似的布局和訓練方法測試大鼠逃生潛伏期。如果大鼠能在60 s內找到平臺并在平臺上休息,就會記錄時間。如果大鼠在60 s內找不到平臺,則將其引導至平臺10 s,時間記為60 s。記錄2次訓練的平均時間。探測測試在最后一次訓練試驗后1 d進行。移除平臺,將大鼠置于新的起始位置自由游泳60 s。

1.2.7 新物體識別測試 使用一個100 cm×100 cm×60 cm有機玻璃競技場設備,探索被定義為在≤2 cm的距離內探索物體或用鼻子接觸物體。計算對象的總探索時間,并通過以下公式計算和分析辨別指數,辨別指數=(探索新事物花費時間-未發現新事物時間)/(探索新事物花費時間+未發現新事物時間)。

2 結 果

2.1 各組大鼠腦損傷程度比較 MCAO模型組腦梗死體積與神經缺陷評分較對照組升高(P<0.05);電針聯合跑輪組大鼠腦梗死體積和神經缺陷評分較MCAO模型組降低(P<0.05)。詳見圖1、表1。

圖1 TTC法評估腦梗死體積

表1 各組大鼠腦損傷程度比較(±s)

2.2 各組炎性因子表達水平比較 MCAO模型組TNF-α、IL-1β陽性細胞數較對照組升高,IL-10陽性細胞數較對照組降低(P<0.05);電針聯合跑輪組TNF-α、IL-1β陽性細胞數較MCAO模型組減少(P<0.05),IL-10陽性細胞數較MCAO模型組增多(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠炎性因子表達水平比較(±s) 單位:%

2.3 各組大鼠BDNF、DOR和TrkB蛋白表達比較 MCAO模型組BDNF、DOR和TrkB蛋白表達較對照組降低(P<0.05);電針聯合跑輪組BDNF、DOR和TrkB蛋白表達較MCAO模型組升高(P<0.05)。詳見表3。

表3 各組大鼠BDNF、DOR和TrkB蛋白表達比較(±s)

2.4 各組大鼠NMDAR、AMPAR、GABAAR和CaMKⅡ mRNA表達比較 MCAO模型組NMDAR、AMPAR、GABAAR和CaMKⅡ mRNA表達較對照組降低(P<0.05);電針聯合跑輪組NMDAR、AMPAR、GABAAR和CaMKⅡ mRNA表達較MCAO模型組升高(P<0.05)。詳見圖2、表4。

圖2 PCR分析NMDAR、AMPAR、GABAAR和CaMKⅡ mRNA表達

表4 各組大鼠NMDAR、AMPAR、GABAAR和CaMKⅡ mRNA表達比較(±s)

2.5 各組大鼠逃生潛伏期比較 第2天和第3天,電針聯合跑輪組與MCAO模型組逃生潛伏期較對照組延長(P<0.05),電針聯合跑輪組大鼠逃生潛伏期與MCAO模型組比較差異無統計學意義(P>0.05);第4天和第5天,MCAO模型組逃生潛伏期較對照組延長(P<0.05),電針聯合跑輪組逃生潛伏期較MCAO模型組縮短(P<0.05)。詳見表5。

表5 各組大鼠逃生潛伏期比較(±s) 單位:s

2.6 各組大鼠辨別指數、總探索時間比較 MCAO模型組大鼠辨別指數較對照組降低(P<0.05),總探索時間較對照組縮短(P<0.05);電針聯合跑輪組大鼠辨別指數較MCAO模型組升高(P<0.05),總探索時間較MCAO模型組延長(P<0.05)。詳見表6。

表6 各組大鼠辨別指數、總探索時間比較(±s)

3 討 論

神經營養因子可改善突觸功能障礙。BDNF通過與TrkB受體結合發揮其神經保護功能。臨床研究發現,有急性缺血性腦卒中病史的病人血清中BDNF水平低于健康者[13-14]。缺血性腦卒中可導致突觸功能障礙,腦卒中后康復的重點是恢復殘余突觸的可塑性。電針可調節BDNF及其受體TrkB的表達。電針的治療通過激活大腦中的內源性阿片系統,緩解了鎮痛和其他疾病的癥狀。電針的眾多可治療穴位中對腦I/R損傷有療效,其治療機制與激活DOR有關。本研究發現MCAO組BDNF蛋白水平低于對照組,在BDNF/TrkB信號通路的下游,TrkB水平的變化反映了BDNF的變化。

針灸和運動可改變神經遞質受體的數量。MCAO手術下調了NMDAR、AMPAR、GABAAR和CaMKⅡ的表達,表明腦卒中可導致認知功能惡化。電針聯合跑輪共同治療可防止MCAO的這些不利影響,但不會誘導NMDAR或AMPAR的過表達。在體外研究中,BDNF與其特異性受體TrkB的結合在抑制炎癥反應和保護神經元方面發揮著重要作用。在抑郁癥的體外和體內模型中,BDNF可上調抗炎細胞因子IL-10、白細胞介素-4(IL-4)和轉化生長因子-β1(TGF-β1),并下調促炎細胞因子IL-1β、白細胞介素-17(IL-17)和TNF-α。外源性BDNF抑制促炎因子的表達并增加抗炎因子IL-10的表達。BDNF可能受DOR的調節。BDNF與DOR在大腦中富含DOR的區域共定位,DOR激活上調BDNF-TrkB信號,降低TNF-α水平并保護皮質免受缺氧損傷。本研究中電針聯合跑輪訓練降低了I/R損傷后促炎細胞因子IL-1β的表達并增加了IL-10表達。此外,電針聯合跑輪訓練治療后,I/R損傷后大鼠的神經功能缺損評分和腦梗死體積明顯降低。電針聯合跑輪訓練可上調腦I/R損傷大鼠腦中BDNF的表達,從而發揮神經保護作用。電針聯合跑輪訓練治療的神經保護作用可能與I/R損傷后通過DOR/BDNF/TrkB通路抑制炎癥有關。MCAO可在動物行為測試中誘發認知障礙。本研究結果顯示,與對照組大鼠相比,MCAO組大鼠在訓練階段需要更長的時間來尋找平臺。在新物體識別測試中,MCAO組在新物體上花費的時間少于對照組。電針聯合跑輪訓練在兩個測試中都扭轉上述現象。表明MCAO組大鼠不僅空間學習和記憶受損,而且識別能力下降,而電針聯合跑輪訓練治療可改善兩種認知測試中的學習和記憶功能障礙。

綜上所述,電針聯合跑輪訓練通過DOR/BDNF/TrkB信號通路抑制炎癥反應,電針聯合跑輪訓練可促進MCAO大鼠模型BDNF蛋白表達并調節突觸可塑性,從而發揮神經保護作用。