基于液相色譜-質譜法技術的膿毒癥代謝標志物研究①

黃荔豐,黃雙蓮,蔡志仕,徐文鑫,黃仲慶,張春斌

(1 漳州衛生職業學院,福建 漳州 363000;2 福建省漳州市醫院急診科,福建 漳州 363000)

膿毒癥發生率高,而且由于早期無特殊癥狀,在臨床上很容易漏診以及誤診,并且病死率高,醫療花費高,嚴重威脅人類生命健康,降低患者生存質量[1]。目前幾乎沒有生物標志物可以準確診斷早期膿毒癥以及預測患者的預后情況。隨著系統生物學檢測技術的發展,利用小分子代謝產物等對早期膿毒癥患者風險和預后進行評估得到越來越多的研究。本研究應用LC/MS技術的正離子模式對成人早期膿毒癥患者和健康成人的外周血進行監測,運用PCA、OPLS-DA、單變量統計分析等多種統計方法對兩者代謝物質進行統計學處理,找出差異,探索尋找早期膿毒癥患者潛在的血清代謝標志物。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019-03～2021-02漳州市醫院急診科及急診病房收治的膿毒癥20例患者作為膿毒癥組,同期健康體檢者20例為對照組。納入標準:(1)符合《國家嚴重膿毒癥和膿毒癥休克治療指南(2012)》;(2)發病年齡>18歲;(3)臨床及實驗室資料完整。排除標準:(1)合并嚴重肝腎疾病;(2)合并惡性腫瘤、血液系統疾病、自身免疫性疾病或感染性疾病;(3)長期接受激素或免疫抑制劑治療。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑

Waters公司ACQUITY UPLC BEH Amide(2.1mm× 100mm, 1.7μm)色譜柱,Thermo Fisher Scientific公司Vanquish超高液相色譜儀。

1.2.2 血樣采集

所有研究對象均于清晨采集隔夜空腹外周血,采集的血樣置于無抗凝劑的真空采血管中,2500rpm離心10min后取上清液置于新EP管中,-80℃冰箱中保存備用。

1.2.3 血清代謝物檢測

取樣本50μL于1.5mL EP管中,加入200μL提取液(甲醇:乙腈=1:1,含同位素標記內標混合物),渦旋混勻30s, 超聲10min(冰水浴);將樣品4℃,12000rpm離心15min,取上清于進樣瓶中上機檢測,所有樣品另取等量上清混合成QC樣品上機檢測。

1.2.4 數據處理和分析

原始數據經ProteoWizard軟件轉成mzXML格式后,使用R程序包(內核為XCMS)進行峰識別、峰提取、峰對齊和積分等處理,然后與BiotreeDB(V2.1)自建二級質譜數據庫匹配進行物質注釋,算法打分的Cutoff值設為0.3,再通過 R(v3.3.2)XCMS 程序分析獲得質核比(mass to charge ratio, m/z)、保留時間(retention time,rt)、峰面積(intensity)等信息的數據矩陣;同時進行峰面積的批次歸一化和標準化處理。使用SIMCA軟件(V16.0.2),對數據進行對數轉換加中心化格式化處理,然后進行自動建模分析[2]。

1.3 統計學方法

采用PCA、OPLS-DA對各組數據進行歸類,去除重復性差的樣本和異常樣本,并得到變量投影重要度(variable importance in the projection, VIP) 值。采用t檢驗得到P值,并且根據P值和VIP值篩選出具有統計學意義的差異代謝物。通過HMDB、Metlin等數據庫進行匹配注釋獲取差異代謝物準確信息,進行代謝物結構鑒定。經層次聚類(hierarchical clustering)分析形成熱圖,觀察兩組之間的差異代謝產物分類情況。通過ROC曲線進一步評價并篩選潛在的生物標記物。采用 KEGG 數據庫對差異性代謝物進行通路富集分析(P<0.05 為差異有統計學意義)。所有統計分析和繪圖均采用 R 軟件進行。

2 結果

2.1 臨床特征

本研究共納入40例標本,膿毒癥組20例,對照組20例。膿毒癥組男12例,女8例,平均(60.05±17.87)歲。對照組男15例,女5例,平均(51.15±11.51)歲。兩組年齡及性別等資料無統計學差異(P>0.05),見表1。

表1 膿毒癥組和對照組基本資料對比(n=20)

2.2 多元統計分析結果

PCA分析結果顯示,膿毒癥組與對照組分布在不同的區域(圖1A),表明病變后血清代謝物組成發生較大差異。進一步構建正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA),得到相應的散點分布圖(圖1B),由圖可知,各樣品組內有很好的聚集性,而兩組之間又有很強的分離性。

圖1 兩組血清代謝組學PCA(A)及OPLS-DA分散點圖

2.3 差異代謝物的篩選

基于OPLS-DA模型,以VIP>1,P<0.05為篩選標準,并利用HMDB、Metlin等數據庫進行驗證,最終得到差異代謝物135個。為了更直觀表示這些化合物含量的變化,采用熱圖進行表示(圖2),從結果可以看出病變組血清代謝物發生了較大改變。計算135個差異代謝物在兩組實驗間的倍數關系(Fold change)值,設定Fold change>5.00或<0.2,找到 17個重要差異代謝物(表 2),并且鑒定出 4個內源性代謝物:5’-甲硫腺苷,異亮氨酸丙氨酸,潑尼松龍和甾體。

圖2 膿毒癥組對健康組的層次聚類分析熱力圖

表2 膿毒癥組與健康組血樣中的重要差異代謝物鑒定結果

2.4 代謝通路分析

經 KEGG 數據庫對膿毒癥患者差異性代謝物的代謝通路進行分析。結果顯示兩組主要差異性代謝物富集于7條代謝途徑:嘧啶代謝,精氨酸和脯氨酸代謝、氮代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝,亞油酸代謝、硫代謝、色氨酸代謝(圖3)。根據代謝通路的P值及影響力值,嘧啶代謝可能是代謝物差異相關性最高的關鍵通路(P=0.0052)。

圖3 代謝通路分析結果

3 討論

膿毒癥患者機體以代謝亢進、高分解代謝狀態及靜息能量消耗增加為主要的代謝特點[3],三大營養物質(糖、蛋白質和脂肪)及其代謝產物比例發生顯著變化。而通過研究膿毒癥患者早期代謝產物的改變,有助于早期診斷膿毒癥。而代謝組學的出現為研究膿毒癥患者整體代謝譜的變化提供了新的契機[4]。本次研究通過運用LC-MS聯用技術測定成人膿毒癥患者與健康人員代謝產物,通過PCA分析和O-PLS-DA分析可見兩組樣本代謝產物差異顯,而且處于95%置信區間,提示兩組樣本的代謝產物具有顯著差異性。將代謝物質經二級質譜定性匹配分析及ROC曲線分析,最終鑒定出 4個內源性代謝物:5’-甲硫腺苷、異亮氨酸丙氨酸、潑尼松龍和甾體。

5甲基硫腺苷(5'-Methylthioadenosine MTA)是一種天然存在的含硫核苷,存在于所有哺乳動物組織中。MTA作為一種代謝物,可以轉化為蛋氨酸,在血漿中的含量為11mmol/L[5～7]。MTA主要通過多胺生物合成途徑由S腺苷甲硫氨酸產生抑制產物。該化合物僅由MTA磷酸化酶代謝,產生5甲基硫代核糖1磷酸和腺嘌呤,分別是蛋氨酸和嘌呤補救途徑中的關鍵步驟。MTA已被證明可以影響許多細胞的關鍵反應包括基因表達、增殖、分化和凋亡的調節。MTA可以增強沙門氏菌感染后的細胞死亡,這歸因于其作為蛋氨酸前體的作用[6]。MTA 還具有甲基轉移酶抑制劑作用[8,9],可以在干擾素反應過程中抑制 Stat1甲基化[10]。MTA在LPS刺激后具有可以阻斷TNF-a的產生[7,10,11]。Peter A Keyel[12]的研究表明MTA 通過腺苷受體重新編程TLR激活途徑以促進炎癥的消退。所有這些都顯示MTA與炎癥介質生成相關的信號通路[13]相關。鄭浩等研究報告也顯示甲硫腺苷與新生兒膿毒癥具有相關性[14]。本次研究中發現5’-甲硫腺苷(MTA)在兩組之間有顯著差異,膿毒癥患者明顯升高,與上述研究相符。

膿毒癥時蛋白質分解增加,其中支鏈氨基酸利用率增加,同時精氨酸的利用率下降,機體對芳香族氨基酸的清除率下降,導致血液中精氨酸及芳香族氨基酸增加,支鏈氨基酸下降。本次研究中早期膿毒癥患者異亮氨酸丙氨酸升高,與上述理論不符合,考慮可能是標本量少,存在誤差。

潑尼松龍片屬于糖皮質激素的藥物,能夠對抗細菌內毒素對機體的刺激反應,減輕細胞損傷,保護機體。甾體是具有環戊烷多氫菲的基本骨架結構的一類天然化學成分,廣泛存在于自然界中。對于這兩種物質與膿毒癥的相關性,國內外研究甚少,仍需進一步驗證。

綜上所述,LC-MS聯用技術可以用于膿毒癥患者代謝譜的研究,MTA等4種代謝物在膿毒癥患者有顯著差異,而MTA有成為早期診斷膿毒癥血清標志物的可能性。今后仍需對差異的代謝產物進一步研究,并深入闡述其生物學意義。本次研究不足之處病例少,多數膿毒癥患者年齡較大,且可能合并多種疾病,可能造成結果偏差較大,仍需增加樣本量進一步研究;并且由于經費所限,僅做了正離子檢測,未做負離子檢測,亦可能影響結果。