不同激素處理對紅顏草莓莖尖萌發和增殖的影響

黃 敏，寧 眺,2，魯峻宏，劉凱麗，袁崇峰，于德嘉，靳 松,2，李 晶,2,4

（1.昆明學院農學與生命科學學院，云南 昆明 650214；2.昆明學院云南省高校都市型現代農業工程研究中心，云南 昆明 650214；3.西南林業大學，云南 昆明 650224；4.香格里拉市藏美農業科技有限公司，云南 香格里拉 674400）

0 引言

草莓是薔薇科草莓屬的多年生草本植物，原產于南美，20 世紀初傳入中國[1-2]。草莓種植面積和產量在漿果類水果生產中僅次于葡萄，2020 年我國草莓種植面積已達13.16 萬hm2，產量也增至344.9 萬t，呈逐年增長的趨勢[3]。紅顏草莓是日本品種，于1999 年引入我國[4]。盡管紅顏草莓不耐熱、不耐濕，但該品種繁殖能力和結果能力強，特別是在云南的氣候條件下，甚至可以結4 茬果實，其果實在成熟后不僅顏色誘人且香味濃，因此在我國各地均有栽培，日漸成為云南省的主栽品種。

草莓傳統的繁殖方法一般是匍匐莖繁殖，但此法會加大草莓攜帶病毒的可能，因而造成草莓果實品質下降[5-6]。采取組織培養的方式培育草莓苗，更經濟有效且能快速地繁殖大量高質量草莓種苗，同時有利于品種資源保存[7]。經過組織培養培育得到的草莓苗在田間表現上也比匍匐莖繁殖的種苗更好。目前，草莓組織培養可分為莖尖分生組織培養、葉片組織培養、花藥和花粉組織培養及原生質體組織培養等[8]。莖尖分生組織培養和花藥培養都是草莓脫毒微繁途徑，但草莓花藥愈傷分化能力較莖尖分生組織低，培育耗時更長。因此，在組織培養育苗上，更多采取莖尖分生組織脫毒方式進行，組織培養育苗已逐漸成為生產草莓苗主要的來源之一[9]。

迄今為止，我國在草莓組培方面也取得了不少成果，無論是品種繁育方面還是種質資源保存上都取得了突出進展[8]。在草莓組織培養過程中，培養基和激素的選擇十分重要，兩者之間的合理搭配是決定組培是否成功的關鍵。值得注意的是，草莓體內的激素含量因不同品種和不同生長階段而有所差異，因此在進行組織培養時對人工添加的激素種類和濃度要求也不同。有研究者對紅顏草莓莖尖組織培養進行了探究，但不同的研究得出的結果均不相同[10-11]。研究者在進行草莓組織培養時采用的外源激素多為6-芐基嘌呤（6-BA）、吲哚乙酸（IAA）和萘乙酸（NAA）等[12-17]。本研究外源激素選取赤霉素（GA3）、6-糠氨基嘌呤（KT）等，探究不同外源激素的組合對紅顏草莓莖尖組織培養的初代萌發及繼代增殖情況等的影響，以期為紅顏草莓莖尖組織培養提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試驗地點

（1）試驗材料。紅顏草莓匍匐莖莖尖采自昆明學院農學與生命科學學院玻璃溫室大棚；MS 培養基（不含瓊脂和蔗糖）采購自青島海博生物科技有限責任公司；瓊脂、白糖、無水乙醇、75%酒精、0.1%升汞、氫氧化鈉、鹽酸和各種植物生長激素等由昆明學院農學與生命科學學院組培室提供。

（2）試驗地點。昆明學院農學樓組培室。

（3）儀器設備。燒杯、量筒、玻璃棒、超凈工作臺、無菌盤、鑷子、接種刀、無菌布、高壓滅菌鍋及組培玻璃瓶等。

（4）培養條件。光照度 2 000～2 500 lx，時間10 h/d，溫度（25±2）°C，濕度 70%～80%。此外，試驗中如不作特殊情況說明，所有培養基中添加MS 4.74 g/L，糖為30.00 g/L，瓊脂為6.80 g/L，pH 值為5.8。

1.2 方法

1.2.1 外植體不同消毒處理

選取新鮮采取的紅顏草莓匍匐莖的莖尖于流水沖洗30～120 min，在超凈工作臺上，分別用75%酒精消毒不同時間，無菌水沖洗3 次，再用0.1%升汞消毒不同時間，無菌水沖洗5 次 ，2 次消毒后無菌水沖洗時間均為30～50 s，將消毒后的莖尖放于接種盤上適當晾干水分，隨后迅速接種到培養基中。20 d 后觀察記錄成活、污染及褐化情況。試驗方案如表1 所示。

表1 不同消毒時間組合試驗設計方案Tab.1 Experimental design scheme for different disinfection time combinations

1.2.2 初代萌芽培養基篩選

以MS 為基本培養基，在培養基中再添加不同濃度的6-BA、NAA 和GA3植物激素進行莖尖萌芽培養。將紅顏草莓匍匐莖的莖尖于流水沖洗至少30 min；在超凈工作臺上，分別用75%酒精消毒30 s，無菌水沖洗3 次，每次30～50 s；再用0.1%升汞消毒10 min，無菌水沖洗5 次，每次沖洗30～50 s；然后將消毒后的莖尖放于接種盤上適當晾干水分，隨后迅速接種到培養基中。每個處理接種10 瓶，每瓶2 根，重復3 次，共9 個處理。誘導培養30 d 后，觀察統計莖尖萌發、褐化和污染情況。培養期間每天觀察莖尖生長情況，及時挑出污染苗并做好記錄。試驗方案如表2 所示。

表2 初代萌芽培養基配方試驗設計方案Tab.2 Experimental design plan for formulation of primary sprouting culture medium

1.2.3 繼代增殖培養基篩選

增殖培養時，同樣以MS 為基本培養基，然后添加不同濃度的激素6-BA、KT、3-吲哚丁酸（I3BA）進行增殖培養。在進行繼代培養接種時，將草莓苗于超凈工作臺進行轉接，盡量選取生長情況較一致的組培苗轉接入不同激素濃度的繼代培養基中。每處理接種10 瓶，每瓶2 根，重復3 次。培育30～45 d 后，觀察統計草莓苗增殖情況。培養期間每天觀察草莓苗生長情況，及時挑出污染苗并做好記錄。試驗方案如表3所示。

表3 繼代增殖培養基配方試驗設計方案Tab.3 Experimental design plan for formulation of subculture medium

1.2.4 計算

試驗有關數據按以下公式計算。

污染率=（污染個數/接種個數）×100%

褐化率=（褐化個數/接種個數）×100%

萌芽（成活）率=（萌芽個數/接種個數）×100%

增殖系數=增殖分化總數/接入總數

1.3 數據分析

數據采用SPSS 22.0 軟件和Excel 進行數據處理、顯著性比較及分析。

2 結果與分析

2.1 不同消毒時間組合對莖尖消毒效果的影響

由表4 可知，不同消毒時間組合對草莓莖尖消毒的效果不同。從成活率來看，9 個處理的成活率為33.33%～83.33%，其中T5處理與其余各處理間均存在差異且差異極顯著（P＜0.005），成活率最高為83.33%；T2處理與T6處理成活率較低，兩者成活率僅為33.33%。從污染率來看，T5處理污染率最低為6.67%，T8處理污染率最高為33.33%，剩余各處理污染率為10.00%～30.00%。從褐化率來看，T8處理與各個處理間均存在差異且差異極顯著（P＜0.005），并且T8處理沒有褐化情況出現，而T2褐化率最高為40.00%。

表4 不同消毒時間組合對草莓莖尖的影響Tab.4 Effect of different disinfection time on strawberry shoot-tip

綜上所述，T5處理成活率最高、污染率最低且褐化率也僅次于T8處理，所以紅顏草莓莖尖最佳的消毒時間組合即為75%酒精消毒30 s，而后再用0.1%升汞消毒10 min。

2.2 不同培養基配方對初代萌芽效果的影響

由表5 可知，在培養基中不同激素濃度配比對草莓莖尖萌芽有不同的影響。S7、S8和S9處理在萌芽上與其余處理間均存在一定的差異，并且3 組處理萌芽率都高達100%；此外，S5處理萌芽率較其他處理都更低，萌芽率為63.33%，剩余處理萌芽率為70.00%～86.67%。從初代萌芽培養污染率方面來看，S2、S3、S4和S5處理污染率都為6.67%，其余處理沒有污染情況，總體上9 組處理污染率都較低，進而驗證了消毒方案的可實施性。在褐化率上，S5處理褐化率最高為30.00%，S3、S6次之，褐化率均為23.33%。

表5 不同培養基配方對草莓莖尖萌芽的影響Tab.5 Effects of different culture medium on shoot-tip germination of strawberry

綜上所述，S7、S8和S9處理都達到了100%的萌芽率，均無污染和褐化的情況。盡管3 組處理的莖尖全部萌芽，但從組培瓶內植株的生長狀況、長勢大小，以及葉片顏色和數量等來看，S8處理較S7、S9處理更好，如圖1 所示。因此，紅顏草莓莖尖萌芽最適激素濃度配比為1.00 mg/L 6-BA、0.20 mg/L NAA，同時還可發現GA3有促進莖伸長的作用，這與于亞軍等[18]的研究結果也相一致，另外，在試驗中還發現了GA3有利于草莓莖尖再生成匍匐莖。

圖1 紅顏草莓莖尖萌發Fig.1 Shoot tip germination of 'Hongyan' strawberry

2.3 不同培養基配方對繼代增殖效果的影響

紅顏草莓初代萌芽培養基選定后，將草莓進行繼代培養，繼代增殖結果如表6 所示。在增殖培養30 d后統計數據分析發現，9 個處理中，J2、J3、J4和J8處理增殖系數偏低未達到2.00 以上，其余處理增殖系數均超過2.00。增殖系數最高的是J1處理，為3.00，在該處理下草莓苗生長較快且生長狀況良好，增殖的叢芽也較多；其次為J6處理，雖叢芽生長數量不及J1處理，但其芽苗生長質量較好且增殖系數也達到了2.60；增殖效果最差的是J2處理，增殖系數僅為1.27。

表6 不同培養基配方對草莓繼代增殖的影響Tab.6 Effects of different culture medium on subculture of strawberry

綜上所述，紅顏草莓繼代增殖的最佳培養基為J1處理：MS+0.50 mg/L 6-BA+0.10 mg/L KT+30.00 g/L糖+6.80 g/L 瓊脂，且pH 值調至5.8。

3 結論與討論

在植物組織培養中，激素起到了非常重要的作用，并且不同植物或不同培養階段所需求的激素種類和濃度也是不同的[19-20]。在草莓組織培養中，因草莓莖尖組織培養可省去愈傷組織誘導這一步驟，因而更為廣泛地作為外植體進行快繁。采用紅顏草莓的匍匐莖莖尖作為外植體，得出了以下結果：紅顏草莓莖尖最佳的消毒方案為75%乙醇消毒30 s，然后再用0.1%升汞消毒10 min，污染率相對較低為6.67%；較適宜的初代萌芽培養基配方為1.00 mg/L 6-BA、0.20 mg/L NAA，這與李曉青等[20]的研究結果相似，萌芽率比其高近16.70%；較優選的繼代增殖培養基配方為MS+0.50 mg/L 6-BA+0.10 mg/L KT，增值系數為3.0。研究結果還表明，草莓組織培養中不同的生長階段所需的生長調節物質種類和濃度是不一樣的，這與張黎鳳等[15]、于超等[19]、陳英等[21]的研究結果相一致。

在消毒部分試驗時，T8污染率遠高于T5，究其原因可能為接種過程中操作不當導致，因此在后續試驗過程需注意這一問題。除此之外，在紅顏草莓增殖培養中，增殖情況與一些研究有一定的差異[22-24]。其中，薛其勤等[24]研究指出，紅顏草莓增殖階段采用0.80 mg/L 6-BA、0.50 mg/L NAA 的激素搭配方式增殖系數高于許多研究，也與本研究差異較大。導致差異較大的原因可能有培養基內接種草莓苗數量不同，激素濃度及種類選擇的差異，草莓生長環境及季節不同而導致的差異，操作過程中由于操作不當使得培養基污染，同時還有部分草莓苗因褐化而沒有增殖等。由此可見，不論是對于草莓組培生長發育過程來說還是對于其余各類果樹花卉而言，植物生長調節物質間濃度的選擇與搭配是至關重要的，同時植物激素的濃度還會因樹種、品種、培養部位等的不同而有一定的差異與變化。因此，在植物組織培養中，從組培苗的各個生長階段角度來看，對植物生長調節劑種類和濃度進行篩選依舊是今后組培工作中的重點與難點[18]。除此以外，研究僅針對紅顏草莓消毒、萌芽及增殖方面進行了試驗，雖對于組培工作有一定的參考意義，但對草莓苗在基礎培養基選擇及褐化等方面的研究還有所缺乏，所以此方面工作也可成為后續工作的一個研究方向。