血microRNA-214表達水平與窒息新生兒神經系統預后的初步研究

韋婷艷 何柳芳 韋桂歡 劉付俊業

新生兒窒息是指新生兒在出生時無法啟動和維持自主呼吸，出生窒息是一種常見的新生兒健康問題，是新生兒發病和死亡的重要原因[1]。目前關于新生兒窒息的具體病因還未確定，可能與能量代謝衰竭、氧自由基和再灌注損傷、興奮性氨基酸的毒性作用等密切相關，但也可能與機體內的腦組織炎癥反應有關[2]。近年來隨著科學的進步，越來越多的研究證實，microRNA（miRNA）參與新生兒窒息的發生發展，其表達的失調與新生兒窒息造成的損傷相關[3]。研究發現，miR-214 在神經元損傷中低表達，高表達的miR-214 可緩解海馬神經元的損傷[4]，此外miR-214 在心血管疾病中也扮演重要角色[5]。然而miR-214 是否也參與了新生兒窒息造成的神經功能障礙還未可知。本研究旨在探究miR-214 與窒息新生兒神經系統預后的相關性，以期為新生兒窒息臨床治療提供參考思路。

1 材料與方法

1.1 研究對象前瞻性連續收集我院2021年3月～2022年3月出生窒息的新生兒30 例（觀察組）和同期出生的正常新生兒30 例（對照組）作為研究對象，觀察組參照2016年中華醫學會圍產醫學分會新生兒復蘇學組制定的新生兒窒息診斷專家共識[6]作出診斷。本研究經深圳市龍華區人民醫院倫理委員會批準并獲得受試者監護人自愿簽署的知情同意書。兩組新生兒一般資料比較差異無統計學意義（P>0.05），見表1。

表1 兩組一般資料比較

1.2 納入與排除標準觀察組納入標準：①胎齡37～41+6周的足月兒；②出生體重>2 500g；③出生時有窒息診斷；④出生24h 內入住新生兒科。對照組納入標準：①胎齡37～41+6周的足月兒；②出生體重>2 500g；③出生時無窒息診斷；④無宮內窘迫史。排除標準：排除患有嚴重感染、低血糖腦損傷、TORCH 感染、膽紅素腦病、中樞神經系統感染、先天畸形及遺傳代謝疾病等的新生兒。

1.3 研究方法miR-214表達水平檢測方法：所有受試患兒均進行臍帶采血（2ml）及出生后3 天、7 天進行外周動脈采血2ml，所有血標本離心（12 000rpm，10min，離心半徑10cm）后取血清，提取RNA 后進行定量，然后使用Taq-ManmiRNA Reverse Transcription 試劑盒將定量的RNA 逆轉錄為模板DNA，以U6 為內參進行RT-qPCR 擴增（95℃預變性10min進行1 個循環，95℃變性15s，60℃復性1min，45 個循環），實驗重復3 次，計算△Ct 值，采用2-△△Ct法計算miR-214 的相對表達水平。miR-214 引物序列為F：5'-CAATACTGACAGCAGGCACA-3'，R：5'-TATGGTTGTTCACGACTCCTTAC-3'；U6 引物序列為F：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，R：5'-AACGCTTC ACGAATTTGCGT-3'。項）：頭豎立反應（頸屈伸肌）、手握持、牽拉反應、直立支持反應，共8 分；③被動肌張力（4 項）：圍巾征、上肢彈回、下肢彈回、腘窩角，共8 分；④原始反射（3 項）：自動踏步、吸吮反射、擁抱反射，共6 分；⑤一般評估（3 項）：覺醒度、哭、活動度，共6 分；5 部分共20 項，總分為40 分；檢查工具包括手電筒、格格球和小紅球各1 個。評定標準：38～40 分為正常，36～37 分為可疑，35 分及以下為異常。

分析新生兒出生后3 天和7 天的血清miR-214表達水平與NBNA 評分的相關性；分析血清miR-214表達水平與NBNA 評分對窒息新生兒的預后影響；miR-214 水平對新生兒窒息的預測價值。

1.5 統計學方法使用SPSS 26.0 軟件對數據進行統計分析，符合正態分布的計量資料采用均數±標準差（±s）表示，兩組間比較使用t檢驗；計數資料采用例表示，使用卡方（χ2）檢驗；重復測量的方差分析比較兩組miR-214 水平；采用Pearson 法分析血清miR-214 水平與NBNA 評分相關性；影響因素的確定使用二元Logistic 回歸分析；ROC 曲線評估miR-214 水平對新生兒窒息的診斷價值，以P<0.05為差異具有統計學意義。

新生兒行為神經測定（Neonatal behavioral neurological assessment，NBNA）評分：所有受試患兒均由經過專業培訓的人員進行評估，室溫在25℃～28℃，保持室內環境安靜，在哺乳后1h 進行測定，并在10min 內完成。

2 結果

1.4 觀察指標記錄兩組患兒臍帶血、出生后第3天、第7 天血漿miRNA-214表達水平和出生后第3 天、第7 天NBNA 評分。NBNA 評分共包括5 部分：①新生兒行為能力（6 項）：對光的習慣形成、對咯咯聲的反應、對說話人臉反應、對咯咯聲的習慣形成、對紅球的反應、可安慰性（指正在哭鬧的新生兒對外界安慰的反應），共12 分；②主動肌張力（4

2.1 兩組新生兒血miR-214 水平、NBNA 評分的比較觀察組新生兒臍帶血、出生后第3 天、第7 天血漿miRNA-214表達水平均低于對照組，差異具有統計學意義（P<0.05），同時隨著出生時間的推移，血漿miR-214表達水平逐漸降低，差異具有統計學意義（P<0.05）；觀察組新生兒出生后第3 天、第7 天NBNA 評分顯著低于對照組，差異具有統計學意義（P<0.05），同時觀察組新生兒第7 天的NBNA 評分高于第3 天評分，且差異具有統計學意義（P<0.05），見表2。

表2 兩組新生兒血miR-214表達及NBNA 評分比較（±s）

表2 兩組新生兒血miR-214表達及NBNA 評分比較（±s）

注：與同組臍帶血比較，*P<0.05；與同組第3 天比較，#P<0.05

分組例數miR-214 水平NBNA 評分（分）臍帶血第3 天第7 天第3 天第7 天對照組300.97±0.280.94±0.271.01±0.1238.31±1.27 38.25±0.89觀察組300.77±0.100.51±0.09* 0.38±0.10*#30.60±1.09 34.94±1.30#t 3.6848.27522.09125.23211.507 P<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05

2.2 血miR-214 水平與NBNA 評分的相關性分析觀察組新生兒出生后3 天和7 天的血miR-214表達水平與NBNA 評分均呈顯著正相關（P<0.05），見圖1。

圖1 血miR-214表達水平與NBNA 評分的相關性分析

2.3 窒息新生兒神經預后影響因素分析以是否為窒息新生兒為二分類因變量（賦值0：沒有發生窒息，1:發生窒息），并以miR-214 水平和NBNA 評分作為自變量，進行Logistic 回歸分析，結果顯示，miR-214 水平和NBNA 評分均為新生兒窒息的相關影響因素（P<0.05），見表3。

表3 Logistic 回歸分析窒息新生兒神經預后影響因素

2.4 miR-214 水平對新生兒窒息的預測價值ROC曲線分析結果顯示，miR-214 水平對新生兒窒息的預測AUC 為0.839；最佳截值為0.633，95%CI為0.732～0.946，其敏感度和特異性分別為90%和73.3%，見圖2。

圖2 miR-214 水平對新生兒窒息預測價值的ROC 曲線

3 討論

miRNA 是近年來的研究熱點，是一種內源性小非編碼RNA，一般由18～24 個核苷酸組成[7]，miRNA 的表達譜已在新生兒窒息疾病中被發現，提示其可能對新生兒窒息發展起重要作用[8]。在人類基因組中，約有700 個miRNAs，主要參與調控細胞分化、代謝、凋亡、血管生成、腫瘤轉移和遷移、神經元發育等重要的生物學過程[9，10]。大量實驗已證實，miRNA 參與神經細胞的保護及缺血后神經再生的調節，如張赫娛[11]在動物實驗中證實，miR-21過表達可增強骨髓間充質干細胞對腦出血大鼠神經功能的恢復。最近的研究發現，miRNA 的差異表達與新生兒窒息相關，可作為早期診斷窒息新生兒神經預后的標志物[12]，但關于miRNA 預測窒息新生兒神經系統的相關報道仍然較少。

本研究發現，窒息組新生兒臍帶及出生后3、7 天的血miR-214表達水平分別為（0.51±0.09）和（0.38±0.10），與對照組的（0.94±0.27）和（1.01±0.12）比較均顯著降低，同時發現隨著時間的推移miR-214表達水平逐漸顯著降低，這提示低表達的miR-214 參與了新生兒窒息的發生。窒息可造成新生兒神經系統障礙，威脅患兒生命健康，王姬[13]在研究中發現，miR-214表達的下調參與了幼鼠神經元的凋亡，同時也在動物實驗中發現，miR-214 的高表達可與PTEN、Bim 和Bax 蛋白結合進而抑制急性神經細胞凋亡[14]。這些結果提示，miR-214 的差異表達與窒息新生兒神經系統障礙相關。

NBNA 是一種評定新生兒行為的良好指標，可以較全面地反映大腦功能，對神經系統的代償性恢復具有重要意義，對神經預后及腦神經異常具有重要的臨床意義[15]。研究已證實，與正常新生兒比較，窒息新生兒的NBNA 評分降低[16]，本研究中，對照組新生兒出生后第3、7 天NBNA 評分為（38.31±1.27）分和（38.25±0.89）分，窒息組新生兒出生后第3、7 天的NBNA 評分為（30.60±1.09）分和（34.94±1.30）分。與對照組相比，窒息組新生兒NBNA 評分明顯下降，提示，窒息組新生兒的神經系統功能下降，陳建濤[16]研究結果中正常患兒的NBNA 評分為（37.16±2.58）分，腦損傷輕度組NBNA 評分為（32.85±2.47）分以及重度組為（28.49±2.46）分，與本研究結果相一致。此外相關性分析發現，窒息組新生兒第3 天和第7 天血清miR-214表達水平與NBNA 評分呈顯著正相關，表明miR-214 的表達水平越低，NBNA 評分就越低，由此推測miR-214 水平可能是反映窒息新生兒神經預后的相關指標。進一步以是否為窒息新生兒為二分類因變量做Logistic 回歸分析，發現miR-214 水平和NBNA 評分是新生兒窒息的相關影響因素，同時ROC 曲線分析表明，miR-214 水平對窒息新生兒神經預后的預測價值較高，具有較高的敏感度和特異性。

綜上，血清miR-214表達水平可較好地反映窒息新生兒神經預后情況，然而本研究仍存在不足之處，如樣本量較少等，以及miR-214表達水平對鑒別新生兒窒息嚴重程度是否同樣具有診斷性還不清楚，仍需進一步的實驗進行驗證。