金胺“O”熒光染色法與萋—尼染色法在肺結核細菌學檢驗中的準確性

王亞茹 呂思遙 鄭牛威 史雯舒

1 天津市河東區疾病預防控制中心 300171;2 天津市紅橋區疾病預防控制中心; 3 天津市水閣醫院; 4 天津市河西區中醫院

肺結核是全球常見的慢性呼吸系統傳染性疾病,主要是因結核分枝桿菌感染引起。結核分枝桿菌早期、快速、準確鑒定,是肺結核治療及管理的重要環節[1]。細菌分離培養法能夠進行菌種鑒定及藥敏試驗,但操作復雜、煩瑣,培養周期長,難以及時予以結果報告[2]。隨著實驗室診斷技術的發展,Xpert MTB/RIF檢測逐漸用于臨床,其操作準確、快速、安全性高,可滿足臨床檢驗需求[3],但其檢驗價格昂貴,患者難以接受。因此抗酸染色法仍在結核分枝桿菌感染的檢測中占據著重要作用,其中萋—尼染色法是重要手段,隨著熒光染色技術的發展,金胺“O”熒光染色法在臨床上的應用取得一定效果[4]。故本文比較金胺“O”熒光染色法與萋—尼染色法對結核分枝桿菌的檢驗準確性,旨為抗酸染色法的選擇提供參考,報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取在2018年1月—2022年10月期間預進行肺結核病篩查的痰標本360份,痰液標本均對應有詳細的病例資料,其中男192例,女168例;年齡30～76(58.31±3.15)歲。納入標準:(1)選取的痰液標本病例均有持續咳嗽、咳痰,伴咯血或有血痰癥狀;(2)發熱、胸痛持續時間超過2周;(3)選取痰液標本合格,為血性、膿性、干酪樣或黏液性痰,痰量超過2ml;(4)均有完整的臨床資料。排除標準:(1)痰液標本不合格或被污染;(2)伴惡性腫瘤、急慢性感染者;(3)臨床資料不全者。

1.2 檢測方法 選取病例晨起痰液,每份痰液制作4張痰涂片,2張為直接痰涂片,2張為次氯酸鈉液化離心沉淀集菌痰涂片。由珠海貝索生物技術有限公司生產的金胺“O”熒光染色液與萋—尼染色液,日本尼康E200型光學顯微鏡,正值相差熒光顯微鏡,100倍油鏡下觀察。

選取痰液內的膿樣、干酪樣及血性物質,劑量在0.05～0.1ml。將挑選的標本均勻涂抹在玻片正面右側2/3部位,使痰膜朝上,厚度適中,形成卵圓形痰膜,10mm×20mm。

萋—尼染色法:在痰標本涂抹于痰膜片后,自然干燥,置于染色架上,先添加石炭酸復紅溶液,覆蓋全部玻片,玻片距離10mm以上進行加熱固定,于5s內對玻片進行火焰加熱,待出現蒸汽后脫離火焰,維持染色5min。流水沖洗后再次添加酸性乙醇美藍溶液,覆蓋全部玻片,脫色1min;若有塊狀紅色殘留,再次對脫色液進行流水沖洗,至痰膜片無紅色;再添加亞甲藍復染液,覆蓋全部玻片,染色時間為30s,用流水將其沖去,瀝干水,待其自然干燥后進行鏡檢。連續觀察300個視野,陰性:未出現抗酸桿菌;陽性(+):每100個視野出現1～9條抗酸桿菌;(++):每10個視野出現1～9條抗酸桿菌;(+++):每1個視野出現1～9條抗酸桿菌;(++++):每1個視野出現至少10條抗酸桿菌;至少觀察20個視野。

金胺“O”熒光法:將處理后的玻片置于染色架上,滴加0.1%金胺“O”染色液,全部覆蓋玻片,放置時間為15min;流水緩慢沖洗,將初染液全部沖去后,添加0.5%鹽酸乙醇進行脫色,持續時間為2min,至外觀無黃色;隨后再次復染,脫色液用流水緩慢沖洗,滴加0.5%高錳酸鉀復染液,全部覆蓋玻片,持續時間為1min;再用流水沖洗復染液,瀝干水分,自然干燥后準備鏡檢。陰性:未出現抗酸桿菌;陽性:(+):每50個視野出現10～49條抗酸桿菌;(++):每1個視野出現1～9條抗酸桿菌;(+++):每1個視野出現10～99條抗酸桿菌;(++++):每1個視野出現至少100條抗酸桿菌;至少觀察20個視野。由兩名經驗豐富、專業性強、工作時間超過5年的檢驗人員觀察及詳細記錄數據。

1.3 觀察指標 (1)比較金胺“O”熒光染色法與萋—尼染色法的檢測價值,以酸性羅氏(L-J)培養基上做痰培養法(L-J痰培養)為金標準,計算兩種染色方法的陽性檢出率,計算其診斷價值:敏感度、特異度、準確性、陽性預測值及陰性預測值;(2)比較兩種染色技術對(+)(++)(+++)(++++)抗酸桿菌陽性檢出率;(3)比較兩種染色法的平均檢驗耗費時間。

2 結果

2.1 兩種染色法檢測結果及診斷價值比較 360例疑似肺結核患者L-J痰培養法檢測,共檢測出陽性124例(34.44%),金胺“O”熒光染色法檢測出陽性120例(96.77%),萋—尼染色法檢測出陽性108例(87.10%),見表1;金胺“O”熒光染色法檢測肺結核的敏感度、特異度、準確性、陽性預測值及陰性預測值均高于萋—尼染色法,差異有統計學意義(P<0.05),見表2。

表1 兩種染色法對肺結核檢測分布情況比較(n)

表2 兩種染色法對肺結核診斷價值比較(%)

2.2 兩種染色方法對抗酸桿菌陽性檢出率比較 金胺“O”熒光染色法對抗酸桿菌陽性檢出率高于萋—尼染色法,差異有統計學意義(P<0.05),見表3。

表3 兩種染色方法對抗酸桿菌陽性檢出率比較[n(%)]

2.3 兩種染色法檢驗耗費時間比較 金胺“O”熒光染色法檢驗耗費時間為(32.14±5.36)min,萋—尼染色法檢驗耗費時間為(47.15±5.48)min,二者差異有統計學意義(t=37.153,P=0.000)。

3 討論

肺結核是我國高發病率的傳染性疾病,控制結核病的傳播首要環節是早期診斷與及時治療。通常臨床診斷肺結核時,多依據結核病細菌學檢查結果。結核分枝桿菌液體培養法診斷敏感度高,可進行菌種鑒定及藥敏試驗,但其操作相對復雜、煩瑣,細菌培養時間長,平均陽性報告時間需要13d,陰性報告時間需要42d[5]。實時熒光檢測(PCR)法能夠在短期內完成細菌培養及檢測,但對于基層醫院而言,各醫院實驗室普遍沒有條件開展,且因實驗室技術人員能力及專業水平參差不齊,更進一步限制其應用[6]。因此痰涂片鏡檢仍是實驗室檢測結核分枝桿菌的主要方法。

結核分枝桿菌細長且略微彎曲,細胞壁脂質含量高,大量分枝菌酸包裹在肽聚糖層的外層,從而會影響染色過程。其中萋—尼染色法是鏡檢的常規染色技術,以5%石炭酸復紅加溫染色,3%鹽酸乙醇避免脫色,再用亞甲藍復染,此時結核分枝桿菌最后呈紅色,而其他細菌以及背景呈藍色[7]。金胺“O”熒光染色法的檢測原理與萋—尼染色法的檢測原理基本相同,均添加一定量的石炭酸,作為媒染劑,以此充分顯示結核分枝桿菌[8]。本文結果顯示,金胺“O”熒光染色法檢測肺結核的敏感度、特異度、準確性、陽性預測值及陰性預測值均高于萋—尼染色法,對抗酸桿菌陽性檢出率高于萋—尼染色法,差異有統計學意義(P<0.05)。結果表明與萋—尼染色法相比,采用金胺“O”熒光染色法可提高結核分枝桿菌的檢出率,診斷價值高。分析原因是萋—尼染色法檢測時,當細菌濃度達到10 000個/ml時,才能被檢測出,難以發現少量細菌,故而陽性檢出率較低;金胺“O”熒光染色法只需要適當加熱處理,促使熒光染料能順利滲透結核分枝桿菌內,在暗背景下,細菌呈現黃綠色熒光,故而能增加細菌檢出率[9]。

本文結果顯示,金胺“O”熒光染色法檢驗耗費時間短于萋—尼染色法,差異有統計學意義(P<0.05)。說明金胺“O”熒光染色法檢測過程較萋—尼染色法簡便,操作時間短,能相應減輕操作人員的工作負擔。分析原因是萋—尼染色法操作較為煩瑣,在染色加熱時容易產生氣溶膠,對檢驗人員身體健康造成一定危害;同時該染色法技術要求高,油鏡觀察時的視野范圍小,鏡檢時間長,檢驗人員容易產生疲勞感[10]。金胺“O”熒光染色法過程中添加熒光染色液,可暗色背景下,細菌可呈現明顯的黃綠色熒光,此時容易被發現,可減輕檢驗人員鏡檢時間及工作負擔,增加工作效率,以此能縮短檢驗時間[11]。

金胺“O”熒光染色法注意事項:(1)熒光染色后涂片需要在24h內完成鏡檢;必要時可置于4℃環境內進行保存,于第2天完成鏡檢,以免時間越久,熒光減退導致陽性結果不準確[12];(2)熒光染色液置于棕色瓶內保存,保存時間不宜超過2周,以免影響熒光染色效果;(3)40×背景下難以區別個別抗酸桿菌,此時需要采用100×油鏡下進行觀察[13];(4)染色時,水流沖洗背面速度宜細弱,避免流水污染熒光素,影響鏡檢結果[14];(5)每張涂片的鏡檢視野數量會影響染色法的診斷靈敏度,當鏡檢視野越多,其檢測靈敏度越高,故建議每張涂片觀察300個視野以上,以此提高臨床診斷價值[15]。

綜上所述,與萋—尼染色法相比,金胺“O”熒光染色法可提高肺結核分枝桿菌陽性率,診斷敏感度、特異度、準確度高,檢測耗費時間短,操作簡單、方便,可提高檢驗人員的工作效率,適用于大批標本檢測,值得臨床應用。但要求人員鏡檢操作經驗豐富,掌握染色流程,注意自身防護,從而提高工作安全性及檢驗質量。