短鏈脂肪酸對肝細胞糖脂代謝調節的作用機制研究

孫亞朝,鄧邦利,牛文彥

（天津醫科大學基礎醫學院免疫學系，天津 300070）

近年來，隨著人們生活方式和飲食習慣的改變，糖尿病在全球的流行趨勢越來越嚴峻。據相關組織預測，全球約有5.37 億成年人患有糖尿病，預計到2030 年，這一數字將增至6.43 億，到2045 年將達到7.83 億[1]。其中2 型糖尿病患者約占所有糖尿病病例的90%，胰島素抵抗是其重要誘因。胰島素抵抗時，主要的胰島素靶組織對胰島素的敏感性降低，胰島素信號轉導減弱和生物作用受損[2]。肝臟是胰島素的重要靶組織，其代謝異常與胰島素抵抗和2 型糖尿病的發生、發展密切相關。餐后血糖升高促進胰島素分泌，胰島素通過血液循環到達肝臟，與肝細胞表面受體結合激活胰島素信號通路，促進肝細胞攝取葡萄糖并轉換為肝糖原儲存，達到降低血糖的作用。肥胖時脂質在肝臟積聚誘發胰島素抵抗，胰島素調節肝臟糖脂代謝能力減弱[3]。因此，靶向調節肝臟糖脂代謝，改善胰島素抵抗，是預防和控制2 型糖尿病發生、發展的關鍵治療策略。

腸道菌群由多種微生物組成，并且是一個較復雜的生態系統，包含250 多種細菌、真菌、病毒等，他們可與宿主共生[4-5]。這些微生物在腸道中產生的大量小分子可調節機體代謝，維持機體代謝平衡[6]。生理狀態下，潛在致病和非致病微生物之間存在平衡，這有助于維持腸道功能和宿主健康。然而，不利的外部刺激可改變參與疾病發病機制的腸道菌群的組成[7-8]，引起腸道菌群代謝物產生的異常，導致代謝異常，涉及胰島素抵抗。腸道菌群代謝產物，包括短鏈脂肪酸（short chain fatty acids，SCFAs）和氨基酸衍生物等，其中SCFAs，主要包括乙酸、丙酸和丁酸[9]。SCFAs 如何影響肝臟糖脂代謝的機制還未完全闡明。本研究用不同的SCFA 孵育小鼠肝細胞，檢測對糖脂代謝的影響及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 AML12 小鼠肝細胞株（廈門大學林圣彩院士惠贈）、胎牛血清、DMEM/F12 培養基、Hank's 平衡鹽溶液（Hank's Balanced Salt Solution,HBSS）（美國GIBCO 公司），蛋白酶抑制劑、乙酸鈉、丙酸鈉、丁酸鈉（美國Sigma 公司），抗Actinin-1 抗體（中國Absin 公司），牛血清白蛋白（中國鼎國生物技術公司），抗β-actin 抗體、抗磷酸化Akt、AMPK、GSK-3β 和ACC 抗體以及AMPK 總蛋白抗體（美國CST 公司），Tannon-5200 化學發光成像系統（北京原平皓生物技術有限公司），增強化學發光底物檢測試劑盒、0.45 μm 孔徑的聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜、二辛可寧酸(bicinchonininc acid，BCA) 蛋白濃度測定試劑盒和RIPA 細胞裂解液（美國Millipore 公司）。山羊抗小鼠抗體、耦聯辣根過氧化物酶的山羊抗兔抗體（美國Jackson Immuno Research 公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 在37°C、5%CO2條件下用含10% 胎牛血清的DMED/F12 培養基培養AML12小鼠肝細胞，接種于75 cm 的細胞培養瓶中，隔天傳代后，將細胞接種于12 孔培養板中。待細胞培養板中的細胞密度達到70%時將1、2、4、8 和16 mmol/L 濃度的乙酸、丙酸和丁酸的鈉鹽分別作用于細胞24 h。

1.2.2 Western 印跡檢測 將配置好的含1 mmol/L Na3VO4、0.5 mmol/L NaF、1 μmol/L PIC 和200 mmol/L PMSF 的RIPA 細胞裂解液4℃預冷。棄去已處理好的12 孔板中細胞的上清液，4℃預冷的HBSS 緩沖液快速洗清細胞兩次，棄去上清液，細頭吸管吸去殘留液，接著將培養板置于冰上。將預冷的RIPA 細胞裂解液按每孔200 μL 的量加入培養板中，冰上靜止20 min，并收集。將收集的裂解液在4℃環境下以13 000 r/min 的轉速離心20 min，取上清，BCA法檢測蛋白濃度。加入LSB，100℃金屬浴溫度下5 min 備用。配置10%的聚丙烯酰胺凝膠，待凝膠凝固后裝置在電泳槽中，加入蛋白樣品，先80 V 電壓電泳0.5 h，再以110 V 的電壓電泳1 h 后，將載有蛋白的聚丙烯酰胺凝膠等組成“三明治”，并放置于轉膜夾中，在恒電壓下轉膜2 h，小刀切取已轉移到PVDF 膜上的目的蛋白的相應條帶，接著用3%牛血清白蛋白室溫封閉目的條帶2 h 后，分別用不同的一抗4℃在搖床上孵育目的條帶過夜后，洗膜液洗膜4 次，每次15 min。接下來將目的條帶置于相應二抗中室溫下搖床上孵育2 h，洗去膜上未結合的二抗。曝光機下檢測各條帶信號，Image J 軟件定量分析。

1.3 統計學處理 采用GraphPad Prism6 統計軟件。用Shapiro-Wilk 檢驗對計量資料進行正態性檢驗，符合正態性分布的資料采用，用獨立樣本t檢驗比較組間差異；非正態性分布資料采用非參數Wilcoxon 秩和檢驗。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SCFAs 對Akt 磷酸化的影響 本部分分別用1、2、4、8 和16 mmol/L 的乙酸、丙酸和丁酸的鈉鹽作用于AML12 細胞24 h，Western 印跡檢測Akt 的磷酸化水平。結果如圖1，乙酸鈉不影響Akt 的磷酸化（圖1A），而16 mmol/L 丙酸鈉顯著升高Akt 磷酸化水平，為對照組的（1.56±0.09）倍（F=3.251，P＜0.05）（圖1B），8 mmol/L 和16 mmol/L 的丁酸鈉顯著增加Akt 的磷酸化，分別為對照組的（1.66± 0.18）倍（F=8.249，P＜0.05）和（2.00±0.16）倍（P＜0.01，圖1C）。

圖1 AML12 細胞中Akt pS473 磷酸化水平Fig 1 The levels of Akt pS473 in AML12 cells

2.2 SCFAs 對GSK-3β 磷酸化的影響 本部分同2.1 處理細胞，檢測磷酸化的GSK-3β。結果顯示，GSK-3β 的磷酸化水平不受乙酸鈉的影響（圖2A），丙酸鈉作用下，GSK-3β 磷酸化水平呈無顯著性升高（圖2B），而8 mmol/L 的丁酸鈉顯著升高GSK-3β磷酸化水平，為對照組的（1.61±0.14）倍（F=4.690，P＜0.05，圖2C）。

圖2 AML12 細胞中GSK-3β pS9 磷酸化水平Fig 2 The levels of GSK-3β pS9 in AML12 cells

2.3 SCFAs 對AMPK 磷酸化的影響 同2.1 處理細胞，Western 印跡檢測AMPK 的磷酸化水平和總蛋白表達。結果顯示，乙酸鈉、丙酸鈉、丁酸鈉在不影響AMPK 總蛋白表達的情況下，不同程度的上調AMPK 的磷酸化水平。當乙酸鈉濃度在2 mmol/L 時即可顯著升高AMPK 磷酸化水平，為對照組的（1.40±0.13）倍（F=4.720，P＜0.05），4 mmol/L 時達最高水平（1.71±0.14）倍（P＜0.01，圖3A）。丙酸鈉在濃度為1 mmol/L 時即顯著增加AMPK 的磷酸化水平，為對照組的（1.66±0.18）倍（F=16.54，P＜0.05），8 mmol/L 時達最高水平（2.45±0.09）倍（P＜0.001，圖3B）。濃度為2 mmol/L 的丁酸鈉即可顯著磷酸化AMPK，為對照組的（1.70±0.13）倍（F=23.50，P＜0.05），8 mmol/L 時達最高水平（2.40±0.16）倍（P＜0.001，圖3C）。

圖3 AML12 細胞中AMPK pT172 磷酸化水平Fig 3 The levels of AMPK pT172 in AML12 cells

2.4 SCFAs 對ACC 磷酸化的影響 同2.1 處理細胞，Western 印跡檢測ACC 的磷酸化水平。結果發現乙酸鈉在濃度為16 mmol/L 時可顯著磷酸化ACC，此時其磷酸化水平為對照組的（2.01±0.30）倍（F=4.807，P＜0.01，圖4A）。4 mmol/L 丙酸鈉顯著升高ACC 的磷酸化，為對照組的（1.66±0.18）倍（F=7.507，P＜0.05），16 mmol/L 時達最高水平（1.93±0.05）倍（P＜0.01，圖4B）。丁酸鈉在濃度1 mmol/L時即可顯著升高ACC 磷酸化水平，為對照組的（1.79±0.06）倍（F=7.028，P＜0.01），8 mmol/L 時達最高水平（1.94±0.14）倍（P＜0.01，圖4C）。

圖4 AML12 細胞中ACC pS79 磷酸化水平Fig 4 The levels of ACC pS79 in AML12 cells

3 討論

機體胰島素抵抗時通常伴隨著2 型糖尿病的發生、發展，此時機體糖脂代謝紊亂，胰島素調節靶組織信號分子的效應減弱。腸道菌群失調與胰島素抵抗和2 型糖尿病相關，與腸道菌群中的產丁酸菌產生的SCFA 有關，SCFA 由丁酸菌在腸道中通過發酵膳食纖維產生[7,10-12]。2 型糖尿病患者體內產SCFA的丁酸梭菌菌群數量有所下降，在接受正常個體移植的糞便后，腸道內產生SCFA 的細菌成分增加，外周胰島素抵抗顯著改善[13]，提示SCFA 可能參與了機體糖脂代謝調節。

肝臟是機體葡萄糖和脂質代謝的主要場所，對維持全身血糖和血脂穩態起重要作用。肝細胞既能消耗葡萄糖，又能產生葡萄糖，血糖濃度決定了肝臟代謝葡萄糖的方式。餐后血糖升高，胰腺分泌胰島素，肝細胞在胰島素刺激下通過葡萄糖轉運蛋白2（glucose transporter 2，GLUT2）攝取葡萄糖。肝細胞中葡萄糖的攝取主要依賴肝細胞膜表面的GLUT2，其介導的肝臟葡萄糖攝取效率較高，當肝臟細胞內葡萄糖濃度高于30 mmol/L 時達到飽和狀態從而開始限制葡萄糖的攝取[14]。隨后在糖原合酶激酶-3（glycogen synthase kinase-3，GSK-3）作用下，進入肝細胞的葡萄糖通過一系列生化反應生成肝糖原，這有助于肝臟繼續攝取葡萄糖，從而降低血糖。在哺乳動物中，GSK-3 有GSK-3α 和GSK-3β兩種亞型，其中GSK-3β 在肝細胞中作用于糖原合酶（glycogen synthetase，GS），使其被激活，進而促進葡萄糖轉化為糖原[15]。GSK-3 在未磷酸化時處于激活狀態，磷酸化后失活[16]。基礎狀態下，GS 的S657 磷酸化位點被酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化，接著在GSK-3 調節下磷酸化GS 的S653、S649、S645 和S641 位點，從而使GS 失活[17-18]。GSK-3 參與胰島素作用下的肝糖原合成，此條件下其受上游分子Akt的調節。Akt 是重要的胰島素信號分子，介導胰島素調節肝臟糖代謝的作用，胰島素抵抗時其磷酸化水平降低[19]。胰島素通過胰島素信號通路IRS-1/PI3K的信號轉導磷酸化Akt，接著GSK-3β S9 和GSK-3α S21 在Akt 的調節下被磷酸化進而使GSK-3 瞬時失活，失活的GSK-3 促進糖原合成酶累積，導致肝細胞內過量的葡萄糖轉化為肝糖原，這就完成了胰島素調節下肝細胞內葡萄糖轉化為糖原的過程[17，20-21]。本研究發現丁酸顯著上調Akt 和GSK-3β的磷酸化水平，提示丁酸具有緩解胰島素抵抗的作用，同時丁酸還可能通過Akt/GSK-3β 途徑促進肝細胞糖原合成，具有降血糖作用。有文獻報道，SCFA通過作用于內分泌細胞增加腸激素PYY 和胰島素分泌而抑制胰高血糖素的分泌，進而增強肌肉和脂肪組織對葡萄糖的攝取[22]。此外SCFA 促進脂肪組織分泌瘦素，而瘦素可增加棕色脂肪組織和肌肉葡萄糖攝取，以及肝糖原合成，進而達到降血糖的作用[22-23]。以上研究表明SCFA 可通過促進或者抑制激素的分泌間接調節血糖，本研究結果提示，在肝臟中，SCFA 具有直接作用于肝細胞而調節血糖的潛能。

肝臟同時也是脂代謝的場所。肝臟可通過三羧酸循環將過量的碳水化合物轉化為脂質，ACC 是AMPK 的下游靶分子，調節脂代謝[16]。其為脂質合成的限速酶，在AMPK 的調節下通過磷酸化和去磷酸化的作用影響脂代謝[24-25]。哺乳動物中ACC 分為ACC1 和ACC2 兩種亞型，而受兩種亞型調節所產生的丙二酰輔酶A 具有不同的生理作用，兩者產生的丙二酰輔酶A 分別調節脂肪酸合成和脂肪酸氧化[26]。ACC 在未磷酸化時處于激活狀態，激活AMPK可使兩種ACC 同時磷酸化而失活，進而導致脂肪酸的合成受抑制，而脂肪酸的氧化水平增加，達到降低脂質水平的作用[25]。本研究發現乙酸、丙酸和丁酸磷酸化AMPK 和ACC1，提示SCFA 可能通過AMPK/ACC 途徑抑制肝細胞脂肪酸合成，進而減少肝臟脂質積聚，緩解胰島素抵抗。

綜 上，SCFA 可 能 分 別 通 過Akt/GSK-3β 和AMPK/ACC 途徑調節糖脂代謝，減少肝臟脂質積聚、降低血糖，進而預防和改善胰島素抵抗。