宮頸癌預后與泛素蛋白1 及免疫細胞群表達特征的關聯性

馬寧，張越

隨著醫療技術及手術條件的不斷提升，宮頸癌根治術很大程度上延長了宮頸癌患者生存時間，降低了疾病病死率。但臨床統計數據顯示，經宮頸癌根治術聯合術后規范化輔助治療后，宮頸癌后期復發率依舊在10%～20%［1］。

宮頸癌的具體致病機制尚不清楚，但免疫功能紊亂與宮頸癌的發生與發展密切相關［2-3］。有研究發現［4］，宮頸癌患者的免疫細胞群失衡，并影響其預后。泛素蛋白1（ubiquilin 1，UBQLN1）是維持細胞內蛋白質穩態的重要物質，能促進錯誤折疊蛋白質降解，參與細胞自噬、凋亡等，在多種惡性腫瘤內呈高表達，并可應用于惡性腫瘤患者預后判斷中［5］。本研究通過分析宮頸癌患者免疫細胞群以及癌灶組織內UBQLN1 表達情況與其臨床病理特征及預后之間的關系，旨在探求宮頸癌可能的致病及復發機制。

1 對象與方法

1.1 研究對象

將2018 年6 月至2020 年1 月晉城大醫院收治的98 例宮頸癌患者納為觀察組。（1）納入標準：患者均符合手術指征，行宮頸癌根治術；術后病理檢查證實為宮頸癌；參照《宮頸癌診治指南》（2012 年）［6］中相關內容行術后規范化治療；隨訪至2022 年1 月，且隨訪資料完整。（2）排除標準：合并其他惡性腫瘤者；既往接受過手術治療或放化療者；臨床資料缺失者。（3）病例資料：98 例宮頸癌患者年齡42～65 歲［（51.11 ± 10.15）歲］，絕經者55 例，國際婦產科聯盟（FIGO）分期：Ⅰ期50 例，ⅡA 期48 例，分化程度：中高分化者60 例，低分化者38 例，合并淋巴轉移者35 例，癌灶直徑＜4 cm 者47 例，≥4 cm 者51 例。同時將同期于同一醫院行健康體檢的60 例同年齡段女性納為對照組，對照組健康體檢均合格，無免疫性疾病或惡性腫瘤，年齡40～66 歲［（53.45 ±8.79）歲］，其中絕經者30 例，且年齡及絕經情況與觀察組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 外周血免疫細胞群檢測 對照組于入組后采集其外周靜脈血5 ml，觀察組在術前抽取其外周靜脈血5ml。檢測儀器為FACSCalibur 流式細胞儀（BD Bioscience，San Diego，CA），檢測試劑包括抗人CD4-FITC 抗體（eBioscience，Cat，NO.11-0048），抗人CD8-PE（eBioscience，Cat，NO.12-0097），抗人CD28-APC 抗體（eBioscience，Cat，NO.17-0289）。檢測方法：采集被研究者外周血于肝素抗凝試管，立即送檢，使用100 μl 全血與適當體積的相應抗體及同型對照抗體室溫避光孵育30 min 后，加入2 ml專用紅細胞裂解液室溫避光孵育10 min，再加入5 ml 磷酸緩沖液（PBS），以1 000 r/min 離心10 min，離心半徑為5.5 cm，棄上清液，洗滌3 次后采用流式細胞儀檢測免疫細胞群分布情況。

1.2.2 免疫組化法檢測UBQLN1 術中收集宮頸癌患者癌組織及癌旁組織，組織切片去蠟油。4 ℃下加入抗UBQLN1 抗體（1∶1 000，ab3341，Abcam）孵育過夜，PBS 洗滌3 次，然后加入HRP 偶聯二抗（1∶300，K8002，Dako）室溫孵育30 min，PBS 洗滌3 次，將染色切片與3'3-二氨基聯苯胺反應10 min，0.1%蘇木素反染。

結果判定：邀請2 名臨床經驗豐富的病理學醫生分別讀片，UBQLN1 表達量以染色強度及陽性細胞占比分數確定。強度記為0～3 分，沒有棕色顆粒、淺棕色顆粒、中等棕色顆粒以及深棕色顆粒分別得0、1、2、3 分；陽性細胞占比記為0～3 分，陽性細胞占比＜10%、10%～39%、40%～69%、≥70%分別得0、1、2、3 分，染色強度及陽性細胞率乘積作為總得分，總得分≤3 分者為低表達者，＞3 分者為高表達者。1.2.3 隨訪及復發診斷 隨訪至2022 年1 月，統計宮頸癌患者復發率：由病理診斷、腫瘤再次出現部位活檢及穿刺病理檢查證實；對于發生遠處轉移者，如肺轉移、骨轉移等無法獲得病理診斷者，依靠癥狀、體征以及輔助檢查行臨床診斷。

1.3 統計學處理

采用SPSS 19.0 統計軟件處理所得數據。計量資料以±s表示，2 組間比較采用t檢驗；計數資料以百分比（%）表示，2 組間比較采用χ2檢驗。繪制受試者操作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評價外周血免疫細胞群及UBQLN1 表達量在預測宮頸癌術后復發中的效能。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 觀察組與對照組外周血免疫細胞群檢測結果比較

觀察組外周血CD8+T 細胞占比高于對照組，CD4+/CD8+比值低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），2 組研究對象CD4+以及CD28+T 細胞占比比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 觀察組與對照組外周血免疫細胞群檢測結果比較（± s）

表1 觀察組與對照組外周血免疫細胞群檢測結果比較（± s）

組別例數CD4+/CD8+觀察組對照組t 值P 值98 60 CD4+T 細胞（%）35.79 ± 6.69 37.48 ± 7.03 1.512 0.133 CD8+T 細胞（%）43.15 ± 7.48 31.03 ± 8.83 9.222＜0.001 0.83 ± 0.21 1.21 ± 0.15 10.059＜0.001 CD28+細胞（%）58.45 ± 10.47 57.66 ± 11.33 0.446 0.656

2.2 觀察組患者宮頸癌組織與癌旁組織內UBQLN1 陽性率比較

宮頸癌組織內UBQLN1 陽性率高于癌旁組織，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 觀察組患者宮頸癌組織與癌旁組織內UBQLN1陽性檢出率比較［例（%）］

2.3 觀察組患者宮頸癌臨床分期與外周血免疫細胞群及UBQLN1 陽性檢出率之間的關系

宮頸癌臨床分期為ⅡA 期的患者外周血CD4+T細胞占比以及CD4+/CD8+比值低于Ⅰ期，CD8+T 細胞占比低于Ⅰ期，差異有統計學意義（P＜0.05），其CD28+T 細胞占比以及UBQLN1 陽性檢出率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 觀察組患者宮頸癌臨床分期與外周血免疫細胞群表達量及UBQLN1 陽性檢出率之間的關系

2.4 觀察組患者宮頸癌淋巴轉移與外周血免疫細胞群表達量及UBQLN1 陽性檢出率之間的關系

宮頸癌淋巴轉移者CD4+T 細胞占比以及CD4+/CD8+比值低于無淋巴轉移者，CD8+T 細胞占比高于無淋巴轉移者，差異有統計學意義（P＜0.05），其CD28+T 細胞占比以及UBQLN1 陽性率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表4。

表4 觀察組患者宮頸癌淋巴轉移與外周血免疫細胞群表達量及UBQLN1 陽性檢出率之間的關系

2.5 觀察組患者宮頸癌組織分化程度與外周血免疫細胞群及UBQLN1 表達量陽性檢出率之間的關系

宮頸癌低分化者外周血免疫細胞群占比與中高分化者比較差異均無統計學意義（P＞0.05），低分化者癌灶組織內UBQLN1 陽性檢出率高于中高分化者，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表5。

表5 觀察組患者宮頸癌組織分化程度與外周血免疫細胞群表達量及UBQLN1 陽性檢出率之間的關系

2.6 觀察組患者宮頸癌病灶直徑與外周血免疫細胞群表達量及UBQLN1 陽性檢出率之間的關系

宮頸癌病灶直徑≥4 cm 者外周血CD4+T 細胞占比及CD4+/CD8+比值均低于＜4 cm 者，差異有統計學意義（P＜0.05）。其CD8+、CD28+T 細胞占比以及UBQLN1 陽性檢出率比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表6。

表6 觀察組患者宮頸癌病灶直徑與外周血免疫細胞群表達量及UBQLN1 陽性檢出率之間的關系

2.7 觀察組患者宮頸癌術后復發與外周血免疫細胞群表達量及UBQLN1 陽性檢出率之間的關系

隨訪至2022 年1 月，共29 例宮頸癌患者確診為復發，復發者外周血CD4+T 細胞占比以及CD4+/CD8+比值均低于未復發者，CD8+以及UBQLN1 陽性檢出率均高于未復發者，差異有統計學意義（P＜0.05）。其CD28+T 細胞占比比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表7。

表7 觀察組患者宮頸癌術后復發與外周血免疫細胞群表達量及UBQLN1 陽性檢出率之間的關系

2.8 觀察組患者外周血免疫細胞群表達量及UBQLN1 陽性檢出率在預測宮頸癌術后復發中的價值

外周血免疫性細胞群CD4+/CD8+比值在預測宮頸癌術后復發中的效能最高，其AUC=0.951，95%CI（0.905～0.997），CD4+、CD8+、CD28+T 細胞單獨應用時在預測宮頸癌術后復發時，CD4+效能最高，其AUC=0.829，95%CI（0.746～0.912），癌變組織內UBQLN1 陽性表達在預測宮頸癌術后復發中的 AUC=0.880，95%CI（0.784～0.935）。見 表8、圖1。

表8 觀察組患者外周血免疫細胞群表達量及UBQLN1 陽性檢出率在預測宮頸癌術后復發中的價值

圖1 觀察組患者外周血免疫細胞群表達量及UBQLN11陽性檢出率在預測宮頸癌術后復發中的價值

3 討論

宮頸癌的發生與人乳頭瘤病毒感染密切相關，但除此之外，機體免疫狀態與宮頸癌的發生及發展也密切相關。機體的抗腫瘤免疫以細胞免疫為主，而T 細胞亞群是調控細胞免疫的中心，同時也是最重要的效應細胞。正常情況下，T 細胞各亞群均處于平衡狀態，當機體發生病理改變時，免疫系統被激活，T 淋巴細胞亞群數量發生改變，免疫平衡狀態被打破［7-8］。

有研究報道［9］，乳腺癌患者CD4+、CD3+水平降低，CD8+及血小板水平升高，且以上免疫因子與乳腺癌腫瘤直徑、病理分級、分化程度、淋巴轉移等病理因素關系密切。蔣立人等［10］研究發現，外周血CD3+、CD4+、CD8+T 細胞數量較低的高級別尿路上皮癌患者預后更差。

T 淋巴細胞是一類在胸腺分化并發育成熟的淋巴細胞，主要介導細胞免疫應答。本研究選擇CD4+、CD8+以及CD28+T 細胞作為研究免疫細胞群，CD4+T 淋巴細胞可輔助與誘導前體細胞，識別瘤細胞分泌的可溶性抗原，并可激活B 細胞、巨噬細胞、自然殺傷細胞，活化抗體生成、巨噬細胞及細胞毒性T 淋巴細胞，放大其免疫效應，是抗腫瘤免疫中重要的免疫因子［11-13］。CD8+T 淋巴細胞是重要的效應細胞，可分為抑制性T 細胞與細胞毒性T 細胞，其中抑制性T 細胞具有負向調節作用，可抑制免疫活化，抑制B 細胞產生抗體，而細胞毒性T 細胞則可直接對抗腫瘤細胞、病毒等，發揮免疫功效［14-15］。CD28+是最重要的協同刺激分子，主要表達于T 淋巴細胞上，能提高T 淋巴細胞的反應性，誘導抗凋亡基因的表達［16-17］。

本研究結果顯示，宮頸癌患者外周血CD8+T 細胞占比高于對照組，CD4+/CD8+比值低于對照組，CD28+及CD4+水平與對照組無異。提示與健康者相比較，宮頸癌患者機體免疫功能紊亂，CD4+/CD8+平衡被打破。本研究進一步分析發現，腫瘤分期為ⅡA 期者、合并淋巴轉移者、腫瘤直徑≥4 cm 者均存在CD4+/CD8+比值下降的特征，提示免疫細胞群CD4+/CD8+失衡與宮頸癌的發生及進展關系密切。

除了免疫功能外，泛素蛋白也與多種惡性腫瘤的發生及發展關系密切。UBQLN1 是泛素蛋白家族中的一員，Zhang 等［18］研究發現，UBQLN1 可通過mTOR/自噬/P53 信號通路介導肺癌A459 細胞增殖與凋亡，參與肺癌的發生。Feng X 等［19］研究發現，乳腺癌UBQLN1 表達水平上調，而抑制UBQLN1 則可抑制乳腺癌侵襲及子宮內膜異位癥。Bao 等［20］研究發現，胃癌組織內UBQLN1 表達水平高于癌旁組織，且UBQLN1 高表達與患者不良預后關系密切。本研究發現，宮頸癌組織內UBQLN1 陽性檢出率為81.63%，明顯高于癌旁組織陽性檢出率的54.08%，且低組織分化癌患者UBQLN1 檢出率明顯高于中高分化者，提示UBQLN1 表達量與宮頸癌組織分化程度有關。

宮頸癌術后復發的預測是患者最為關心的，準確預測宮頸癌術后復發風險，在臨床工作中有著指導意義。為研究免疫細胞亞群及UBQLN1 在預測宮頸癌術后復發中的價值，本研究隨訪至2022 年1月，共統計出29 例復發。比較發現，復發者外周血CD4+T 細胞占比以及CD4+/CD8+比值均低于未復發者，CD8+T 細胞占比以及UBQLN1 陽性檢出率均高于未復發者，提示外周血免疫細胞失衡，以及UBQLN1 過度表達均可能影響宮頸癌術后復發。

繪制ROC 曲線提示，CD4+/CD8+比值低于0.79，以及宮頸癌組織內UBQLN1 高表達在患者術后癌癥復發中均具有良好的應用效能，可作為宮頸癌術后復發的預測參考指標。但受限于研究設計，本研究并未對免疫細胞群失衡與UBQLN1 表達量之間的關系進行深入研究，未探討兩者在宮頸癌復發中的作用機制，存在一定的缺陷，可作為下一步研究的方向。

綜上所述，宮頸癌患者外周血免疫細胞群水平及UBQLN1 表達水平在預測患者術后復發中具有一定價值，可作為宮頸癌術后復發預測的潛在指標。