胃癌精準診斷的核酸生物標志物研究進展

李巧楠,王 婷,張焜和

(南昌大學第一附屬醫院消化內科,江西省消化疾病研究所,南昌 330006)

胃癌是全球第五大常見癌癥,也是第四大癌癥相關死因,估計2020年全球新發胃癌病例超過100萬例,死亡病例估計76.9萬例[1],嚴重威脅人類健康。手術切除仍是胃癌最有效的治療方法,但因早期癥狀不明顯,胃癌診斷時多數為中晚期,錯過最佳手術時機,5年生存率仍不理想。目前胃癌診斷依賴于胃鏡檢查和活檢,但其有創性、費用高、資源不足和較高的技術要求,難以用于胃癌的篩查,因而胃癌的早期診斷仍面臨巨大挑戰。因此,通過精準診斷,實現精準治療,可能是目前提高胃癌療效、改善預后的關鍵途徑。

胃癌精準診斷需要借助相關分子標志物的檢測和應用。然而,傳統的血清腫瘤標志物,包括癌胚抗原(CEA)、糖類抗原19-9(CA19-9)、糖類抗原125(CA125)和糖類抗原72-4(CA72-4),在胃癌的診斷中價值有限[2]。為了改變胃癌缺乏有效標志物的現狀,近年來開展了大量胃癌相關核酸分子及其臨床診療意義的研究,包括微小RNA(miRNA)、環狀RNA(circRNA)、長鏈非編碼RNA(lncRNA)、外泌體源性RNA、Piwi蛋白互作RNA(piRNA)、循環游離DNA(cfDNA)和循環腫瘤DNA(ctDNA)等。結果顯示它們對胃癌的診斷、轉移、臨床分期、復發監測、預后評判等具有不同價值,在胃癌的精準診斷方面有良好的潛在應用價值。為此,本文就上述核酸分子標志物在胃癌精準診斷方面的研究進展進行綜述。

1 miRNA

miRNA是含有18～25個核苷酸的非編碼RNA,能調控基因表達,在細胞和組織的增殖、分化、發育和凋亡等生物學過程中發揮重要作用[3]。miRNA作為新型生物標志物,在胃癌的診斷和治療中具有較大潛在價值。

miRNA在胃癌組織中的表達水平可以發生明顯改變,并與胃癌的生物學行為有關。JEDDI等[4]發現,miR-200a和miR-28在胃癌組織中表達水平顯著下調,且miR-28表達越低,胃癌體積越大、組織學分級越高、淋巴結和遠端轉移發生率越高。BAO等[5]報道miR-148a-3p在胃癌組織和血漿中均顯著下調,過表達miR-148a-3p可以抑制胃癌細胞的增殖表型、轉移表型和癌干細胞樣特性,從而抑制胃癌的進展。miRNA可通過腫瘤相關分子或信號通路而影響胃癌的生物學行為,如胃癌中miR-1292-5p可以抑制原癌蛋白DEK而影響胃癌細胞的生長、遷移和侵襲[6];miR-653-5p通過作用細胞因子信號轉導抑制因子6(SOCS6)促進胃癌細胞增殖和轉移[7],表明miRNA可作為治療靶點的候選者,從而為胃癌的治療提供新的思路。

血漿和尿液中的miRNA在胃癌精準診斷中具有重要的潛在應用價值,特別是早期胃癌。CHEN等[8]發現,血漿中miR-421表達上調發生于胃癌前病變和胃癌早期,其診斷胃癌的AUC、敏感度、準確度優于傳統腫瘤標志物(CEA、CA125、CA153、CA211和CA50),而其特異度高于CEA、CA153和CA50(均P<0.05)。此外,IWASAKI等[9]檢測了胃癌和健康對照者尿液中miRNA的表達水平,發現miR-6807-5p和miR-6856-5p在胃癌患者中表達上調,術后下降到低于檢測下限,將它們與幽門螺桿菌感染狀態聯合檢測,對胃癌有良好診斷價值(AUC=0.885),且可以區分Ⅰ期胃癌和健康對照者(AUC=0.748)。因此,miRNA作為診斷早期胃癌的新型生物標志物具有較大潛力,能鑒別胃癌與其他胃良性疾病。

2 circRNA

circRNA是一類閉合的非編碼RNA,無5′端帽狀結構和3′端polyA結構[10]。因閉合的環狀結構而不易被RNA酶降解,circRNA在人體細胞中具有高穩定性、廣泛性、高保存性[11],有望成為癌癥的新型生物標志物。

2013年,HANSEN等[12]首次發現circRNA可作為miRNA的海綿而參與基因表達和調控,并影響轉錄后過程。此后不少研究證實circRNA主要作為miRNA的海綿而發揮作用。DENG等[13]發現circRHOBTB3充當miR-654-3p的海綿,通過激活p21信號通路抑制胃癌的生長。LIU等[14]也發現circ-MAT2BGC在胃癌細胞中顯著升高,并作為miR-515-5p的海綿增加HIF-1α表達,參與circ-MAT2B/miR-515-5p/HIF-1α的正調控網絡。CAO等[15]證實hsa_circ_0008259(circLMO7)作為miR-30a-3p海綿影響WNT2/β-Catenin通路,促進胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲。此外,circRNA還能通過抑制蛋白活性發揮抑癌作用。ZHANG等[16]在小鼠腫瘤模型上發現,hsa_circ_0061137(circDIDO1)編碼的529aa蛋白能直接與聚ADP-核糖聚合酶1(PARP1)相互作用而抑制其活性;另外該研究還發現circDIDO1與過氧化還原蛋白2(PRDX2)特異性結合,促進RBX1介導的PRDX2泛素化和降解,從而導致其下游信號通路失活而發揮抑癌作用,進一步說明circDIDO1發揮抑制胃癌作用,這為胃癌診斷和治療提供了新的靶點。

circRNA不但與胃癌的生物學行為密切相關,其在胃癌患者的體液和癌組織中的表達水平也發生改變,可作為潛在的胃癌標志物。LI等[17]分析了胃癌患者與健康對照血漿中的circRNA差異表達譜,發現hsa_circ_0001017和hsa_circ_0061276對胃癌有良好的診斷價值,兩者聯合的AUC為0.912,靈敏度為0.847,特異度為0.966,且它們在胃癌組織中的低表達與遠處轉移有關,血清水平低者生存時間更短,術后恢復正常者預后更好。XU等[18]也發現circ_0004771在胃癌組織中表達上調,其血漿水平明顯高于淺表性胃炎和正常對照,診斷胃癌的總AUC為0.831,鑒別胃癌與淺表性胃炎的AUC為0.845,胃癌術后血清circ_0004771恢復正常,復發后再度升高,可見circ_0004771能良好鑒別胃癌與胃良性病變,并且有望成為一種新的血清標志物監測胃癌狀態。

3 lncRNA

lncRNA是長度超過200個核苷酸的RNA。大多數lncRNA通常不是翻譯成蛋白質,而是作為功能性RNA分子參與基因表達調節、染色質重塑、細胞分化和胚胎發育[19]。

lncRNA廣泛存在于胃癌患者的癌組織和體液中。LIU等[20]發現,在胃癌組織、細胞系和血清中lncRNA HOXA11-AS表達上調,其中其血清水平降低與腫瘤大小、TNM分期和淋巴結轉移呈負相關,診斷胃癌的AUC高達0.924。KE等[21]發現4種lncRNA(AK001058、INHBA-AS1、MIR4435-2HG和CEBPA-AS1)在胃癌患者的血漿中顯著升高,聯合診斷胃癌的AUC高達0.921。FENG等[22]使用實時定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)技術檢測胃癌患者、息肉患者和正常對照組血清中lncRNA B3GALT5-AS1的表達水平發現,胃癌患者的B3GALT5-AS1水平明顯高于正常人,AUC為0.816,B3GALT5-AS1可作為區分胃癌患者與健康人的診斷標志物。由此可見,lncRNA在胃癌患者組織和體液中高表達,是一種有潛力的胃癌的非侵襲性診斷標志物。

許多lncRNA可作為miRNA的海綿,在胃癌的發生發展中發揮作用。JIANG等[23]發現lncRNA KLF3-AS1在胃癌細胞中表達下調,其作為miR-223的海綿抑制胃癌細胞增殖、生長,且能增強胃癌細胞對順鉑的敏感性,但在胃癌中的具體分子機制仍需進一步研究。ZHAO等[24]發現IncRNA LINC00339在胃癌中過度表達,可充當miR-539的海綿調節SRY-Box 9(SOX9),在胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲中起著關鍵作用。此外,LIU等[25]發現與正常對照組相比,lncRNA RP11-874J12.4在胃癌組織和細胞系中表達升高,作為miR-3972的海綿而調節RP11-874J12.4/miR-3972/SSR2軸增強MKN-45和AGS胃癌細胞對化療藥物抵抗力,可作為胃癌診斷和治療的靶點。

4 外泌體源性RNA

外泌體是細胞分泌的具有磷脂雙分子層結構的囊泡物質,平均直徑為100 nm[26],其中含有蛋白、脂質、非編碼RNA等物質。外泌體于20世紀80年代被提出[27],認為外泌體是細胞內的“垃圾袋”,可以通過轉移其中特定物質來進行局部和遠處的細胞間通信而參與許多生物過程。其有可能成為胃癌精準診斷的標志物,近年來已成為研究熱點。

外泌體來源的lncRNA對胃癌的診斷有較大的價值。早期胃癌的診斷備受關注,LIN等[28]在早期胃癌血漿中發現一種特異性外泌體lncRNA——lncUEGC1,鑒別早期胃癌與健康個體和慢性萎縮性胃炎的AUC分別高達0.8760和0.8406,說明lncUEGC1有望成為早期胃癌的新型標志物。ZHAO等[29]發現,與正常健康人比較,外泌體lncRNA HOTTIP在胃癌血清中表達上調,診斷胃癌的AUC為0.827,顯著高于CEA、CA 19-9和CA72-4;進一步發現HOTTIP的血清水平還與胃癌的浸潤深度、TNM分期和生存期顯著相關,可能具有診斷和預后評價的雙重價值。另有研究[30]發現外泌體中轉錄因子FOXM1相關的lncRNA(FRLnc1)在胃癌細胞、組織和血清中的表達均上調,在血清外泌體中尤為明顯(診斷胃癌的AUC為0.863),并證實胃癌細胞來源的外泌體通過轉運FRLnc1促進胃癌的生長和轉移。

外泌體來源的circRNA也與胃癌相關,可能是胃癌潛在的標志物。有研究[31]發現胃癌組織和血清中外泌體circSHKBP1(hsa_circ_0000936)的表達增加,其水平與TNM分期和生存率呈負相關,且在胃癌切除術后表達水平明顯下降;進一步研究發現circSHKBP1可調節miR-582-3p/HUR/VEGF途徑,抑制HSP90降解,從而促進胃癌進展,有可能成為胃癌治療探索的新方向。ZHENG等[32]發現,與正常對照組相比,外泌體hsa_circ_0015286在胃癌組織、血漿和癌細胞中的表達水平均升高,診斷胃癌的AUC分別為0.778、0.673和0.665,三者聯合檢測AUC可提高到0.843。由此推斷外泌體來源的circRNA在胃癌中可作為診斷、治療和判斷預后的新型生物標志物。

外泌體來源的miRNA在胃癌診療中的意義已有不少報道,其對胃癌的診斷價值優于血清miRNA,并與胃癌的轉移、分期等相關。WEI等[33]發現胃癌血清外泌體中的miR-15b-3p高于正常對照,其診斷胃癌的AUC為0.820,優于癌組織和血清中miR-15b-3p對胃癌的診斷價值(AUC分別為0.674和0.642),還發現血清中外泌體源性miR-15b-3p可以預測胃癌患者的總生存期,外泌體源性miR-15b-3p診斷胃癌具有更高的靈敏度,同時也是胃癌預后指標。ZHENG等[34]檢測了218例血清樣本的外泌體miRNA-590-5p表達水平,其在健康對照組、早期(Ⅰ和Ⅱ)胃癌組和晚期(Ⅲ)胃癌組的表達水平使用2-ΔΔCT法計算分別為30.34±6.35、6.19±0.81和2.9±0.19,診斷胃癌的AUC為0.810,敏感度為63.7%,特異度為86.0%,并與胃癌的浸潤深度、TNM分期和生存期密切相關。因此,外泌體來源的miRNA在胃癌的診斷和預后中有重要價值。

與血漿或血清中的RNA分子相比,外泌體中的RNA分子具有以下優點:外泌體的含量與供體細胞的含量密切相關,使基于外泌體的RNA分子檢測具有更高的特異性;外泌體穩定存在于各種生物液體中,其中的RNA分子可免受RNA酶的降解。因此,外泌體來源的RNA分子作生物標志物有良好的診斷價值。

5 piRNA

piRNA是具有21～35個核苷酸的一類小非編碼RNA,與piwi家族蛋白相互作用。人類中有30000多種piRNA基因,在轉座子沉默、表觀遺傳調控和生殖系發育中發揮作用[35]。近年來,有研究[36]表明piRNA在胃癌、膀胱癌、乳腺癌、結直腸癌和肺癌等各種癌癥中異常表達。

VINASCO SANDOVAL等[37]在胃癌組織中發現698個piRNA,其中piR-48966、piR-49145、piR-31335在胃癌與癌旁組織間存在差異表達。CHENG等[38]使用qRT-PCR發現piR-823在胃癌組織中的表達水平顯著低于非癌組織,增加piR-823表達量,細胞生長受到抑制,說明piR-823在胃癌中有重要價值,但這只停留在小鼠模型階段。另一項研究[39]發現,胃癌患者胃液中的piR-1245水平高于健康對照,區分兩者的AUC為0.885,進一步發現胃液中piR-1245高表達的胃癌患者的總生存期和無進展生存期較差。因此,piRNA可能是有前途的診斷和預后生物標志物,但目前為止,piRNA與胃癌發生發展的機制尚不明確,仍需要進一步研究。

6 ctDNA和cfDNA

源于腫瘤細胞的DNA片段進入血液循環即為ctDNA[40],與血液中的其他游離DNA共同構成cfDNA。cfDNA可以在健康人的血清或血漿中檢測到,但大多數cfDNA來源于凋亡或壞死的腫瘤細胞。

早在2011年,有研究[41]發現胃癌患者血漿cfDNA水平比正常健康組高2～3倍。PARK等[42]在54例胃癌患者和59名匹配的健康對照中,發現胃癌組血漿cfDNA的平均水平比對照組高出2.4倍,cfDNA在胃癌患者血漿中高表達,這為診斷胃癌帶來了可能性。ZHANG等[43]檢測了胃癌患者術前和術后cfDNA濃度和完整性,發現胃癌患者的術前cfDNA水平明顯高于術后,術后2種指標也明顯高于健康對照組,表明血漿cfDNA濃度測定可能適用于檢測胃癌。HUANG等[44]分析了血漿cfDNA提取物中的ssDNA與dsDNA的比值,發現胃癌患者這一比值明顯低于健康對照組,診斷胃癌的AUC為0.923,且該比值在不可切除胃癌明顯低于可切除胃癌,表明該比值在胃癌診斷有較大的潛力,對能否行外科手術有預測價值,此外,該比值還不受溶血和反復凍融的影響,可能是一項穩定性好的指標。值得注意的是,在一項前瞻性研究中,CABEL等[45]使用PCR技術檢測了非轉移性胃腺癌患者圍手術期化療期間血漿ctDNA水平,發現術前胃癌患者中沒有一個具有可檢測的ctDNA水平(N=0/18),術后只有一個患者具有可檢測的ctDNA水平(1/13),認為ctDNA檢測的敏感性較差,不是預測非轉移性胃癌化療和術后復發療效的有用工具,然而,這種低檢出率背后的機制仍不明確,可能需要進一步研究和開發更敏感的檢測技術。

cfDNA和ctDNA用作腫瘤液體活檢的檢材,具有重復性好、創傷小等特點[46],有望成為胃癌精準診斷的生物標志物,但將其轉化為臨床實際應用仍面臨巨大挑戰。ctDNA的檢測和定量受其不穩定性和動態變化的限制,cfDNA水平在健康受試者中也升高,提示缺乏癌癥特異性,因此,有必要改進ctDNA和cfDNA的檢測技術,以獲得更有價值的檢測結果。此外,雖然cfDNA和ctDNA能帶來腫瘤相關信息,但它們與原發腫瘤之間有一定差異,并不能完全代替原發腫瘤,只能發揮補充作用。

7 總結與展望

CEA等傳統血清腫瘤標志物,盡管在胃癌的分期和術后復發監測方面有一定價值,對胃癌的診斷價值非常有限。新型核酸標志物,包括microRNA、circRNA、lncRNA、外泌體源性RNA、piRNA等,與胃癌的生物學行為和疾病狀態有較密切的關系,診斷價值優于傳統血清生物標志物,有可能在胃癌的精準診斷中發揮重要作用,但相關研究目前尚處于初級階段,距離臨床應用還有較大差距。就臨床角度而言,目前的研究一般為小樣本的單中心研究,需要大樣本、多中心的前瞻性研究驗證它們的價值。從技術層面來看,涉及的檢測技術多數較為復雜而臨床實用性差,需要不斷優化和簡化以適應臨床需要。另外,由于胃癌的異質性,單個腫瘤標志物對胃癌的診斷價值不一定理想,可能需要2種或2種以上指標聯合,才能進行更精準的診斷,這進一步增加了研究的難度。盡管如此,由于血液腫瘤標志物檢測具有簡便、易于重復、創傷小等優點,有理由相信,隨著研究的深入和技術的改進,生物標志物將為胃癌的精準診斷提供重要支撐。