小麥矮腥黑粉菌效應蛋白g10613的基因克隆與生物信息學分析

郭志浩，高利，劉琦

（1.中國農業科學院植物保護研究所/植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193；2.新疆農業大學農學院/農林有害生物監測與安全防控重點實驗室）

小麥矮 腥黑粉菌（Tilletia controversa Kühn，TCK）所引發的小麥矮腥黑穗病是一個主要的國際檢疫性病害，其對農業生產構成嚴重威脅[1]。這種真菌可以通過種子、土壤及空氣等傳播并且可以在土壤中生活很多年，一旦被引入就很難被根除[2]。

本研究利用小麥矮腥黑粉菌基因組數據克隆出小麥矮腥黑粉菌的一個效應蛋白基因g10613，對該蛋白基因進行克隆以及生物信息學進行分析，為小麥矮腥黑粉菌的后續相關研究奠定基礎[3]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株：小麥矮腥黑粉菌菌株，由中國農業科學院植物保護研究所麥類真菌病害研究組儲藏供應。

供試試劑：2×Taq 酶、2×Phanta酶購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司?？敲顾?、Kanamycin sulfate（Biosharp）、質粒提取檢測試劑盒買于北京天根生物技術有限公司，凝膠材料純化回收檢測試劑盒買于北京天根生物技術有限公司。其他試劑盒為實驗室常用試劑盒。試驗于2021年在中國農業科學院植物保護研究所麥類真菌病害研究組實驗室進行。

主要儀器設備：FastPrep -96高通量快速樣品制備儀（美國MP Biomedicals公司）、PCR儀（美國賽默飛世爾技術有限公司（Thermo Fisher Scientific））、離心機（德國eppendrof生命科學公司）、高壓滅菌鍋（美國zealway公司）、GHB-202恒溫金屬?。ㄕ憬┤占夹g公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 小麥矮腥黑粉菌效應蛋白基因的克隆

取培養基中的各階段TCK，按試劑盒說明書方法提取RNA。再利用試劑盒將RNA合成cDNA。根據TCK基因組設計的引物數據設計全長序列引物g10613-F，g10613-R；以TCK的cDNA為模板進行了PCR擴增，反應體系包括：cDNA模板1 μL，2 × 酶12.5 μL，引物g10613-F 1 μL，引物g10613-R 1 μL，ddH2O 9.5 μL等，共25 μL。

擴增程序為：98 ℃30 s，（98 ℃10 s，55 ℃5 s，72 ℃10 s）×35個循環，72 ℃1 min。采用瓊脂糖凝膠電泳驗證PCR產物，跑出符合預計長度的目的片段。將目的片段用切膠處理，送到北京擎科生物技術有限公司進行檢測。

1.2.2 生物信息學分析軟件

運用ProtParam軟件（https：//web.expasy.org/protparam/）分析蛋白質理化性質，TMHMMServerv.2.0軟件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預測其跨膜區，運用NCBI 中的Conserved Domains 軟件（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）分析其結構域，使用SOPMA軟件（https：//npsaprabi.ibcp.fr/ cgi-bin/ npsa_automat.pl? page=%20npsa_sopma.html）進行蛋白二級結構分析，用Swiss-Model軟 件（https：//swissmodel.expasy.org/）進行蛋白三級結構建模[4]。

2 結果與分析

2.1 小麥矮腥黑粉菌基因g10613的克隆

用引物g10613-F和g10613-R（表1）擴增出約330 kb的目的基因片段。將PCR 凝膠產物回收，測序后獲得330 bp長度的序列，如圖1所示。

圖1 基因g10613的PCR擴增產物

2.2 小麥矮腥黑粉菌效應蛋白生物信息學分析

2.2.1 效應蛋白g10613的保守結構域分析

對g10613基因進行保守結構域分析，g10613基因長度為330 bp，共編碼了109個氨基酸，它沒有明顯的家族結構特征。

2.2.2 效應蛋白g10613理化性質分析

效應蛋白g10613的相對分子質量為11 723.80，相對理論等電點PI為9.06，說明了蛋白質的偏堿。蛋白質的總分子式是C504H826N142O150S14，分子數量是1 636。而氨基酸總數則是109個，其中其中Ala（A）8 個（7.3%）、Arg（R）3 個（2.8%）、Asn（N）6 個（5.5%）、Asp（D）6個（5.5%）、Cys（C）10個（9.2%）、Gln（Q）2個（1.8%）、Glu（E）3個（2.8%）、Gly（G）11個（10.1%）、His（H）0個（0%）、Ile（I）5個（4.6%）、Leu（L）6個（5.5%）、Lys（K）14個（12.8%）、Met（M）4個（3.7%）、Phe（F）2個（1.8%）、Pro（P）6個（5.5%）、Ser（S）4 個（3.7%）、Thr（T）8 個（7.3%）、Trp（W）2 個（1.8%）、Tyr（Y）2個（1.8%）、Val（V）7個（6.4%）。Asp和Glu的總數即負電性殘體總數為9個，而Arg和Lys的總量即正電荷殘體總數為17個。g10613蛋白的不穩定指數是29.78，屬于穩定蛋白。脂肪指數為65.32，而總平均親水性則為-0.252。預測該蛋白質的半衰期將是：在哺乳動物的網織紅血球中超過30 h，在酵母中超過20 h，以及在大腸桿菌感染中超過10 h。

分析該蛋白的親疏水性，最疏水性數值是3.433，而最親水數值則為-2.844。如圖2所顯示，在g10613效應蛋白中親水的氨基酸數量更多，是偏親水蛋白質。

圖2 效應蛋白g10613的親疏水性圖

2.2.3 效應蛋白g10613信號肽分析

效應蛋白g10613信號肽分析，切割位點C的最高值為0.851，位于第22位氨基酸；信號肽分數S的最高值為0.939，位于第2位氨基酸；合并后切割位點的Y最高值約為0.867，位于22位氨基酸。S平均值為0.811，所預測的切割位點約在1～21位氨基酸之間。如圖3所示。

圖3 效應蛋白g10613信號肽預測

2.2.4 效應蛋白g10613跨膜區分析

效應蛋白g10613跨膜區分析，通過對跨膜區的預測發現，在效應蛋白g10613的全部109個氨基酸中，存在一個跨膜區，處于0～23氨基酸的位置，如圖4所顯示。

圖4 效應蛋白g10613的跨膜區預測

2.2.5 效應蛋白g10613二級結構預測分析

效應蛋白g10613二次結構預測分析，二次結構分析結果表明，該氨基酸具有α-螺旋、延伸鏈、β-轉角和不規則卷曲。其中，有44個氨基酸形成α-螺旋占40.37%，7個氨基酸形成延伸鏈，占6.42%；5個氨基酸形成β-轉角，占4.59%；53個氨基酸形成不規則卷曲，占百分之46.82%，如圖5所顯示。

圖5 效應蛋白g10613的二級結構預測

2.2.6 效應蛋白g10613三級結構預測分析

利用SwissModel 軟件，對效應蛋白g10613三級結構預測，如圖6。

圖6 效應蛋白g10613的三級結構預測

3 討論

小麥矮腥黑粉菌所導致的小麥矮腥黑穗病，在其通常流行的年份的發病率與發病率下降的速度大致相同。這種真菌所引起的小麥矮腥黑穗病是一種重要小麥類病害，在國際上這種真菌病害也具有相當的影響力。當環境條件適宜，有大量的感病植株時，可造成50%的產量損失，有的嚴重病害地塊產量損失高達80%[5]，甚至滅絕。但即便如此，我們對小麥矮腥黑粉菌的發病機制仍然缺乏系統深入地了解。

病原菌在侵染植物時，在與寄主細胞的相互作用的同時，會分泌許多蛋白，這些分泌蛋白被稱為“效應蛋白”。研究表明，許多已經被確認的病原菌分泌蛋白質所存在的典型特點是：具有遠端信號肽序列，該序列可以引導蛋白質完成跨膜運動，從而促進蛋白質被轉移到細胞膜外。

由于效應蛋白是病原菌侵染植物時的重要武器，在病原菌感染植物的整個過程中起著重要的作用，因此對小麥矮腥黑粉菌效應蛋白的研究有助于闡明小麥矮腥黑穗病與小麥矮腥黑粉菌之間的互作機理。

本文成功克隆出小麥矮腥黑粉菌編碼效應蛋白的g10613基因，并對該效應蛋白基因進行了克隆和生物信息學分析，但該效應蛋白的作用機制尚未清楚。本研究為下一步研究小麥矮腥黑粉菌效應蛋白的功能，深入分析基因g10613及編碼的效應蛋白在小麥矮腥黑粉菌中的具體功能，以及其影響小麥植物體的方式的研究奠定了良好的基礎。