甜瓜遺傳轉化技術的優化及DRs類基因的應用

萬麗麗, 王轉茸, 湯 謐, 張學軍, 任 儉, 曾紅霞, 張 娜, 孫玉宏, 朱志坤

(1.武漢市農業科學院,湖北武漢 430065; 2.新疆農業科學院哈密瓜研究中心,新疆烏魯木齊 830091;3.新疆農業科學院海南三亞農作物育種試驗中心,海南三亞 572014; 4.湖北省武漢市蔡甸區農業農村局,湖北武漢 430199)

甜瓜是葫蘆科甜瓜屬一年生蔓性草本植物,果實營養豐富,是一種色、香、味俱佳的重要水果。甜瓜的類型品種非常豐富,根據植物學、生態學、農業生物學特征特性,將甜瓜分為兩大類,即厚皮甜瓜和薄皮甜瓜。隨著栽培技術、生長環境以及農產品供應市場的變化,現代園藝作物育種目標除了豐產、抗病、優質、早熟性狀的要求更具體化,又提出了更多新的目標如可觀賞性、營養強化以及與農業全產業鏈配套相結合等。種質資源是新品種選育的基礎,目前種質資源創新的主要途徑有3個,一是利用育種過程中產生的新品系及種質材料;二是利用天然突變或者誘變育種獲得新育種材料;三是利用全基因組及泛基因組測序、來源不同種質資源的全基因組關聯研究(GWAS)分析、重要性狀遺傳群體構建及目標基因精細定位等獲得有育種價值的基因資源,進而利用分子標記技術、基因工程技術如轉基因、基因編輯技術等創制豐富的種質資源[1-2]。

植物的遺傳轉化是通過將生物體基因組中所需的目的基因構建到表達載體中,通過科學技術方法將其轉入到植物體內并成功表達,定向改變原材料遺傳性狀并獲得穩定遺傳表型的新品種的過程[3]。常用的遺傳轉化方法有直接轉化法[包括聚乙二醇(PEG)介導法、電穿孔法、超聲波法、基因槍法]、花粉管通道法和細胞轉化法等。第二載體轉化系統,主要包括農桿菌介導法和病毒介導法。目前最常用的轉化方法為農桿菌介導法,包括含有Ti質粒的根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)和含有Ri質粒的發根農桿菌(A.rhizogenes)。在農桿菌介導植物細胞轉化過程中,Ti(Ri)質粒上的一段可轉移的DNA(T-DNA)會隨機插入植物基因組中,在植物體內轉化后表達使得植物再生。目前農桿菌介導法應用最為廣泛,適用于幾乎所有的雙子葉和單子葉植物。該方法具有轉化效率高、遺傳穩定性強、多以單拷貝或者低拷貝形式整合到植物基因組、基因沉默發生概率低等優勢。目前已經在水稻、玉米、小麥、大豆、番茄等主要農作物中成功應用[4-5]。在甜瓜遺傳轉化研究中,離體再生是農桿菌介導轉化的前提,目前以子葉為外植體進行離體再生是最為成熟的方法,器官直接再生途徑對甜瓜具有普適性從而奠定了遺傳轉化的基礎[6]。然而目前甜瓜遺傳體系不完善,轉化再生植株陽性率低。為了提高轉化再生效率,研究者從2個關鍵因素入手開展研究。一方面是農桿菌介導的遺傳轉化率。不同葫蘆科作物基因型對農桿菌的敏感性存在差異,比如在西瓜遺傳轉化試驗中,EHA105的最高轉化效率為0.92%,GV3101的轉化效率為0.88%,LBA4404轉化率為0%[7]。農桿菌的生長狀態和活力對浸染效率影響較大,-80 ℃儲存的農桿菌需要進行1～2次活化,達到對數生長期時活力最強。轉化方法同樣是提高轉化效率的核心,利用再生能力強的細胞與農桿菌充分接觸,采用納米刷、超聲波和真空滲透處理等方式可以減小農桿菌進入植物細胞的阻力[8]。另一方面是提高轉化后細胞誘導胚再生能力。近年來,研究者通過超表達發育調控因子(DRs)可以極大地提高遺傳轉化效率[9-13]。在西瓜中超表達擬南芥AtGRF5、嵌合基因TaGRF4-OsGIF1和ZmWUS-ZmBBM能夠顯著提高遺傳轉化再生植株陽性率[7]。利用西瓜內源嵌合基因ClGRF4-GIF1可以將西瓜遺傳轉化效率提高9倍,突變ClGRF4內部的miR396的靶向位點能夠將遺傳轉化效率提高到67.2%[14]。除了激素誘導芽再生,植物組織受傷也能夠促進器官發生,AP2/ERF轉錄因子WOUNDINDUCEDDEDIFFERENTIATION1(WIND1)能夠促使受傷位點的細胞脫分化并誘導愈傷組織形成,超表達WIND1以及同源基因WIND2-4能使得愈傷組織在無外源施加激素下繼續生長[15-16]。此外,AP2/ERF轉錄因子PLT3、PLT5和PLT7參與機械損傷后維管組織的修復和再生,主要是通過與CUC2基因啟動子直接結合后上調其表達,提高內源生長素含量從而促進維管組織再生[17]。

本研究以5種不同基因型厚皮甜瓜和4種不同基因型薄皮甜瓜為材料,利用農桿菌介導子葉外植體轉化方法,從而篩選最優誘導芽再生培養基激素組合,適用于甜瓜的Basta除草劑濃度,促進農桿菌介導甜瓜子葉的浸染方法以及超表達不同發育調控基因(AtGRF5、AtWUS、AtPLT5、AtWIND1)對甜瓜遺傳轉化再生及轉化效率等方面的研究,建立穩定高效的遺傳轉化技術體系,為甜瓜的基因功能鑒定及生物技術育種提供有效的途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料 本試驗所用厚皮甜瓜材料為都蜜5號(A1)、玉菇(A2)、雪蜜(A3)、檸檬蜜(A4)、虹玉(A5),21C-1自交系(C1),21C-2自交系(C2),薄皮甜瓜材料為美濃(B1)、綠寶(B2)、武農青玉(B3)、羊角蜜(B4),121自交系(D1),LB自交系(D2)。其中自交系種質在武漢市農業科學院武湖試驗基地繁殖。

1.1.2 遺傳轉化載體和菌株 植物表達載體pV16B和PFGC5941載體圖譜如圖1所示。試驗所使用的大腸桿菌(Escherichiacoli)感受態為DH10B,農桿菌感受態為EH105。

1.2 試驗方法

1.2.1 發育調控基因的擴增 從擬南芥TAIR數據庫中篩選得到AtGRF5(AT3G13960)、AtWUS(At2g17950)、AtPLT5(At5g57390)和AtWIND1(At1g78080)的編碼序列(CDS),參考ClonExpress Ⅱ one step Cloning Kit (C112,Vazyme Biotech Co.,Ltd,南京) 引物設計方法(表1),由天一輝遠生物科技有限公司合成。PCR反應體系:擬南芥cDNA 2 μL(50 ng/μL)、上游引物2 μL(50 μmol/L)、下游引物2 μL(10 μmol/L),2×Phanta Max Buffer 25 μL,Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1 μL,用ddH2O定容至50 μL。混勻上述PCR反應體系后按照如下程序擴增,反應程序:95 ℃ 3 min;95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 1.5 min,35個循環;72 ℃ 10 min。經過瓊脂糖凝膠電泳檢測,將正確的目標條帶回收。

表1 DRs類表達載體構建相關引物

1.2.2 重組載體構建 用限制性內切酶NcoⅠ和BamH Ⅰ對PFGC5941質粒進行酶切。反應體系:

PFGC5941質粒 1 μg、NcoⅠ內切酶 0.7 μL(10 U)、BamHⅠ內切酶 0.7 μL(10 U)、10×Reaction Buffer 5 μL,用ddH2O定容至50 μL。37 ℃酶切3～4 h后膠回收。將“1.2.1”節中的目標片段與線性化PFGC5941載體通過同源重組連接,具體步驟參考ClonExpress Ⅱ one step Cloning Kit詳細說明,37 ℃ 30 min后轉化大腸桿菌,過夜培養篩選陽性克隆進行菌液PCR鑒定陽性重組子并送武漢擎科生物科技有限公司測序。

1.2.3 遺傳轉化載體 植物表達載體pV16B,包含植物抗性選擇標記Bar(圖1-A)。以PFGC5941載體為骨架,利用NcoⅠ和BamHⅠ酶切位點將AtGRF5(AT3G13960)、AtWUS(At2g17950)、AtPLT5(At5g57390)和AtWIND1(At1g78080)的CDS導入,所得的植物雙元表達載體命名為AtGRF5、AtWUS、AtPLT5、AtWIND1(圖1-B),轉化農桿菌EHA105。

1.2.4 菌液制備及侵染 取5 μL 重組載體質粒轉化農桿菌感受態EHA105,28 ℃培養2 d,挑取單克隆于5 mL含有50 μg/mL卡那霉素、25 μg/mL 利福平的液體LB培養基中,28 ℃搖菌(200 r/min)培養14～16 h。之后吸取200 μL菌液于裝有20 mL液體LB培養基的150 mL三角瓶中,28 ℃搖菌(200 r/min)培養12～16 h。

1.2.5 不同濃度Basta除草劑篩選 取未浸染農桿菌的子葉外植體接種在3種濃度(2、5、10 mg/L) Basta除草劑的SIM培養基上篩選,培養環境為 25～26 ℃,7～14 d繼代1次,4周后觀察再生,考察外植體褐化數量。根據外植體褐化死亡的數量確定合適的篩選濃度。

1.2.6 在不同濃度激素組合培養基中誘導不定芽分化試驗 為了確定適合于不同甜瓜材料子葉外植體不定芽誘導再生的激素組合,本試驗參考黃瓜遺傳轉化試驗中激素組合6-BA和ABA[8],設置3個不同濃度組合(0.5 mg/L 6-BA+1 mg/L ABA,1 mg/L 6-BA+1 mg/L ABA,2 mg/L 6-BA+1 mg/L ABA),用于篩選獲得誘導不定芽的激素組合。計算再生外植體比例=(能產生再生芽的外植體數/接種外植體總數)×100%。

1.2.7 農桿菌介導的遺傳轉化試驗培養基種類 發芽培養基(germination medium,GM)基礎培養基為MS培養基(蔗糖30 g/L,瓊脂粉8 g/L),0.5 mg/L 6-BA和1 mg/L ABA,pH值為5.85。農桿菌浸染培養基(inoculation medium,IM)基礎培養基為MS培養基(蔗糖30 g/L),0.5 mg/L 6-BA和1 mg/L ABA,1.25 mmol/L嗎啉乙磺酸(MES),pH值為5.70,高溫滅菌后,加入200 mmol/L 乙酰丁香酮(AS)。共培養培養基(co-cultivation medium,COM)基礎培養基為MS培養基(蔗糖30 g/L,瓊脂粉8 g/L),0.5 mg/L 6-BA和1 mg/L ABA,1.25 mmol/L MES,250 μmol/L硫辛酸(LA),pH值為5.70,高溫滅菌后,加入 200 mmol/L 乙酰丁香酮AS。不定芽誘導培養基(shoot induction medium,SIM)基礎培養基為MS培養基(蔗糖30 g/L,瓊脂粉8 g/L),根據不同基因型材料子葉外植體在 6-BA和ABA激素組合上不定芽再生率確定合適的濃度,pH值調節為5.85,高溫滅菌后,加入200 mg/L Timentin抑菌劑和2 mg/L AgNO3。生根培養基(root induction medium,RIM)基礎培養基為MS培養基(蔗糖30 g/L,瓊脂粉 8 g/L),pH值為5.85,高溫滅菌后,加入200 mg/L Timentin抑菌劑和2 mg/L AgNO3。

1.2.8 農桿菌介導的子葉外植體的遺傳轉化 (1)子葉外植體準備。挑選飽滿甜瓜種子,溫湯浸種2～3 h,剝除種殼,用75%乙醇消毒1 min,1.5%次氯酸鈉處理10～15 min,無菌ddH2O沖洗3次,8～10 min/次。種子消毒后置于GM培養基上,28 ℃ 暗培養48 h,觀察種子露白后將子葉橫切成兩半,保留近胚根端的一半,將胚根從胚上掰除,使得胚上出現“U”形缺口,此時的胚用于農桿菌浸染試驗。(2)浸染農桿菌的準備。農桿菌EHA105包含植物雙元表達載體pV16B(包含植物抗性選擇標記Bar和GFP表達組件)。在LB(含50 mg/L卡那霉素和 25 mg/L 利福平)固體平板上劃線,28 ℃培養48 h,挑取單克隆接種于YEB(含有50 mg/L 卡那霉素和 25 mg/L 利福平)液體培養基中,28 ℃,200 r/min 振蕩培養24 h至D600 nm為0.5～0.6。5 000 r/min 離心收集菌體,用IM培養基重懸收集菌體,調節至D600 nm為0.3～0.4備用。(3)農桿菌浸染方法。用納米刷(KITA,Nanotek Brush)對外植體近“U”形口區域一個方向輕刷表面4～5次以保證胚的表面出現微傷口,之后置于含有農桿菌懸浮液的三角瓶中。將外植體置于超聲波儀器(KQ-100DV)中10 s,之后轉移到真空干燥箱中,分別在-0.3、-0.5、-1.0 kPa壓力下處理90 s。上述試驗結束后將外植體置于無菌濾紙上吸干多余菌液,轉移到鋪上1層濾紙的COM培養基上,其中外植體背面朝下與濾紙直接接觸。在26 ℃條件下暗培養72 h。(4)不定芽誘導培養。將共培養結束后的外植體用含有200 mg/L Timentin抑菌劑的無菌水漂洗3次,用無菌濾紙吸干表面水分,轉移到SIM培養基(含合適濃度的Basta)中,其中“U”形口端插入培養基中,培養3 d后在熒光顯微鏡下觀察外植體表面是否有熒光,培養14 d后繼代培養,直到再生芽出現在熒光顯微鏡下觀察。轉化GFP外植體陽性率=(GFP熒光外植體數量/接種外植體總數)×100%;轉化GFP再生植株比例=(能再生GFP陽性芽的外植體數量/接種外植體總數)×100%。(5)生根培養。將有GFP熒光芽的外植體轉移到生根培養基中,直至根系正常發育后移至營養缽成苗。上述遺傳轉化試驗在武漢市農業科學院作物所實驗室完成,一個完整的試驗周期大約需要3個月。

1.2.9 DRs類表達載體轉化甜瓜外植體再生率以及陽性率分析 將DRs類表達載體(如圖1-B)轉化甜瓜A1、A2、B1、B2的外植體,在0.3 mg/L 6-BA 和Basta篩選劑的培養基上生長,統計能夠再生芽的外植體數量。根據DRs載體上Bar基因設計引物BarF:5′-ATCGAGACAAGCACGGTCAA-3′、BarR:5′-CTGAAGTCCAGCTGCCAGAA-3′,檢測再生芽轉化的陽性率。再生芽外植體比例=(能再生芽的外植體數量/接種外植體總數)×100%。

1.3 數據處理

試驗數據采用單因素方差分析和Duncan’s 多重比較分析不同處理之間的差異,差異顯著性水平為α=0.01或者α=0.001,所有的統計分析均在SPSS 26.0中完成。

2 結果與分析

2.1 甜瓜子葉外植體對Basta篩選劑的耐受性分析

將厚皮甜瓜A1～A5,薄皮甜瓜B1～B4在施加2、5、10 mg/L Basta除草劑的MS培養基上,培養4周后開始統計外植體褐化死亡數量。如圖2可見,大多數厚皮甜瓜和薄皮甜瓜外植體在2 mg/L Basta培養基上能夠正常生長6周,但是第8周會開始褐化死亡。在 5 mg/L Basta培養基上生長4周后外植體變黃色并于6周褐化死亡,死亡率在80%以上,在10 mg/L Basta培養基上生長4周外植體全部褐化死亡。因此選擇5 mg/L Basta作為遺傳轉化的篩選濃度。

2.2 不同濃度激素組合甜瓜不定芽誘導再生分析

甜瓜子葉外植體置于3種不同濃度激素組合的不定芽誘導培養基,分別為0.5 mg/L 6-BA和 1 mg/L ABA (簡稱T1),1 mg/L 6-BA和 1 mg/L ABA (簡稱T2),2 mg/L 6-BA和 1 mg/L ABA(簡稱T3)。1周后“U”形口區域開始膨大,14 d后產生不定芽(圖3-A)。統計14 d后能夠再生長度≥1 cm 不定芽的外植體比例,不同基因型甜瓜子葉在T2和T3培養基中誘導≥1 cm長度不定芽的再生頻率極顯著地高于T1培養基的誘導率。但是隨著6-BA濃度從1 mg/L提高至2 mg/L,在大多數材料子葉外植體的“U”形口區域會產生大量芽叢或者類似于芽的結構,而正常葉形且長度≥1 cm芽的數量相比T1培養基再生芽的數量有所減少(圖3-B)。

2.3 不同真空滲透壓下轉化效率和再生效率分析

為了提高農桿菌浸染轉化外植體的效率,本試驗對A1～A5、B1～B4甜瓜子葉用納米刷處理后置于含有pV16B的農桿菌菌液中超聲波處理10 s,之后分別置于-0.3、-0.5、-1.0 kPa壓力的真空滲透儀器中處理90 s,共培養3 d后,轉移到SIM培養基培養4～5 d,在熒光顯微鏡下觀察,統計有GFP熒光的外植體數量并計算轉化率(圖4-A)。繼續培養6周后統計外植體的存活率以及含有GFP熒光的不定芽數量并計算轉化GFP再生芽的比例。結果顯示,上述甜瓜子葉外植體在-1.0 kpa真空滲透壓下轉化率最高(圖4-B),3種真空滲透壓作用下甜瓜子葉外植體的存活率沒有顯著差異(圖4-C)。經過在SIM培養基上培養8周,統計具有GFP熒光的不定芽數量,結果顯示,在-1.0 kPa真空滲透壓處理后轉化pV16B外植體具有GFP熒光的不定芽數量極顯著(P<0.001)高于-0.3 kPa和 -0.5 kPa 真空滲透壓處理(圖4-D)。

2.4 在甜瓜中超表達不同類型DRs表達載體統計再生出芽外植體的比例

選擇優良厚皮甜瓜種質C1、C2和薄皮甜瓜種質D1、D2分別轉化CON(未含有DR表達組件對照載體)、AtGRF5、AtWUS、AtPLT5和AtWIND1遺傳轉化載體,之后將子葉外植體轉移到低濃度6-BA (0.03 mg/L)和5 mg/L Basta培養基上培養,4周后統計產生不定芽的外植體數(圖5-A),計算具有再生能力外植體比例。結果顯示,在低濃度細胞分裂素以及Basta篩選劑作用下,在C1和D2種質中4種DRs元件的外植體再生出芽能力極顯著高于不含有DRs表達元件的外植體再生能力;C2和D1的AtGRF5以及D1的AtPLT5轉化后再生率極顯著高于CON;C2中表達AtPLT5和AtWIND1,D1中表達AtWUS和AtWIND1的再生率顯著高于CON(圖5-B)。對所得到的超表達DRs再生植株進行PCR鑒定分析,分析再生陽性苗率(再生陽性苗率=再生陽性苗/接種外植體×100%)(表2),超表達AtGRF5和AtPLT5的C1和C2、超表達AtPLT5的D1,超表達AtGRF5的D2的轉基因陽性苗占外植體比例極顯著高于相應的對照CON。

表2 超表達DRs遺傳轉化甜瓜種質的分析

3 討論與結論

選擇適宜的外植體是遺傳轉化成功的關鍵因素之一,子葉、莖段、頂芽、幼胚、莖尖、胚軸等都具有轉化能力。不同外植體或者同一外植體的不同發育階段轉化效率差異較大。具備分裂能力的細胞轉化的效率最高。本研究在不同基因型甜瓜遺傳轉化試驗中,選取種子在28 ℃預培養24～48 h,此時胚根長度為0.2～0.5 cm時的子葉外植體近軸端芽再生能力最強,并且在預培養基中加入細胞分裂素促進細胞分裂提高代謝活躍性,對遺傳轉化至關重要。另一方面提高農桿菌浸染外植體效率也是遺傳轉化試驗中關鍵技術環節,很多研究者通過超聲波處理、玻璃微珠處理、刀片微創和硼酸鋁晶須等方法對外植體造成創傷[18-20],促進農桿菌與傷口區域充分接觸。本研究采用納米刷對甜瓜子葉外植體創制微傷口,此外與超聲波和真空滲透處理相結合,減小農桿菌進入子葉外植體細胞的阻力[8]。試驗結果顯示,在-1.0 kPa真空滲透壓處理后外植體的轉化率最高,然而造傷和農桿菌雙重因素極易產生嚴重損傷,進而影響外植體的存活率和再生能力。研究表明,在培養基中添加一些抗氧化劑如硝酸銀(AgNO3)、半胱氨酸(Cys)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、硫辛酸(LA)和二硫蘇糖醇(DTT)等降低浸染后外植體褐化和死亡率[21-24]。其中LA是一種含硫抗氧化劑,廣泛存在于原核和真核生物中,主要通過直接清除活性氧和活性氮,螯合金屬離子發揮抗氧化作用,循環再生其余內源抗氧化劑,增加線粒體膜電位和細胞氧消耗來降低活性氧產生等,最終實現有效減少氧化應激反應的發生[25]。本研究在共培養基中添加低濃度的LA以減輕外植體造傷脅迫后的褐化,在誘導芽再生培養基中加入乙烯抑制劑AgNO3能夠提高細胞中酶的活性,促進不定芽的再生。除了采用物理的方式提高農桿菌侵染外植體的效率,利用革蘭氏陰性細菌如丁香假單胞桿菌的分泌系統T3SS在農桿菌中表達,將三型效應子T3Es如AvrPto、AvrPtoB、HopAO1運送到細胞中,以阻斷植物PTI反應來提高農桿菌介導的轉化效率[26]。

注:同列數據后不同大寫字母表示每種甜瓜種質處理間差異極顯著(P<0.001)。“ns”表示沒有統計。

植物的再生和遺傳轉化是基因工程應用的基礎。然而遺傳轉化及細胞再生能力由受體植物基因型與植物生長調節劑作用下的復雜調控網絡所決定[27]。發育調控基因如WUS、PLT、ARF、GRF、LEC1、LEC2、BBM、LBDs、CUC1、CUC2、CLV3、STM和ESR是一類決定植物細胞命運的關鍵因素,它們的表達與愈傷組織的形成和植株再生能力緊密相關[28-29]。目前發育調控因子被挖掘并應用到農桿菌介導的組織培養和植物地上部注射轉化試驗[30]。WUS和BBM基因已經應用到單子葉作物再生研究中,在難轉化的玉米自交系中超表達BBM和WUS2基因能夠顯著提高組織培養的轉化效率,但是WUS和BBM基因在雙子葉植物中應用的成功案例較少[13,31]。Maher等將含有來源于玉米的WUS2、STM和IPT與CRISPR元件共表達的農桿菌混合后注射到煙草側芽生長點獲得遺傳轉化且基因編輯的植株[30]。GRF基因是植物特異的轉錄因子,常以GRF-GIF轉錄復合體的形式促進營養和生殖器官原基細胞的發育。其中超表達GRF5能夠促進愈傷組織分化以及芽的形成[10]。PLT5是植物組織受傷后莖稈維管修復的重要調控基因,在擬南芥中超表達PLT5能夠促進在無細胞分裂素培養基上愈傷組織再生得到苗[32],在高濃度細胞分裂素作用下,PLT5誘導表達量超過WUS,從而促進了芽的再生[33]。當PLT5和WUS共表達時,能夠協同促進胚性愈傷組織的形成并重塑細胞發育途徑獲得再生芽。WIND1也是植物機械損傷后促進傷口處維管形成層細胞分裂并交織連接的關鍵基因,在無外源植物生長調節劑作用下超表達擬南芥的WIND1能夠促進愈傷組織分化,表達調控網絡相關基因分析得出WIND1能夠直接上調ESR1基因的表達從而激活CUC1介導的芽再生發育途徑[34]。由于上述部分DRs基因可以在沒有細胞分裂素的培養基中誘導胚發生,為避免在高濃度植物激素作用下超表達DRs基因會導致再生芽畸形、植物形成困難的問題,本研究在低濃度細胞分裂素的培養基中,超表達AtGRF5、AtWUS、AtPLT5和AtWIND1能夠促進甜瓜“U”形口不定芽的正常再生,其中AtGRF5和AtPLT5在個別甜瓜材料中促進再生芽比例與對照相比呈現極顯著差異。AtPLT5的作用是細胞全能性的獲得(pluripotency acquisition),促進愈傷組織的分化進而轉向胚性芽再生發育途徑,AtWIND1是促進芽原生分生組織(shoot promeritem)分化,AtWUS是芽祖細胞(shoot progenitor)形成的基因,決定著再生器官如芽組織的分化,在芽從頭形成的信號途徑中,PLT基因位于最上游。GRF基因與GIF形成復合體調控著植物器官原基細胞的分化,超表達GRF類基因能夠促進植物器官的發生[10],此外GRF5與GIF1-SWI/SNF形成復合體繼而解除PRC2復合體對其他發育調控因子的抑制,最終重塑細胞再生[29]。因此,面對甜瓜遺傳轉化效率偏低的現狀,需要依據模式作物分生組織再生調控途徑,結合甜瓜維管形成層的發育特征,充分利用DRs基因資源才是重要的解決途徑。