高脂飼料對(duì)草魚生長、肝臟脂肪蓄積、脂肪酸組成及腸道微生物的影響

高科迪，任艷華，樊海瑩，張玉茹＊

（1.河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007；2.河南省水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，河南 新鄉(xiāng) 453007）

隨著我國經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，淡水魚養(yǎng)殖市場(chǎng)需求不斷增加，再加上養(yǎng)殖者對(duì)經(jīng)濟(jì)效益的更高追求，我國淡水魚養(yǎng)殖業(yè)正朝著密度增高、投入增多和集約化養(yǎng)殖的方向闊步進(jìn)發(fā)。但在高密度養(yǎng)殖模式下，草魚肝臟中脂肪的過度蓄積會(huì)誘導(dǎo)脂肪肝等代謝性疾病的產(chǎn)生，影響草魚肝臟的代謝功能，進(jìn)而影響草魚肉質(zhì)，降低養(yǎng)殖效益[1]。哺乳動(dòng)物中的研究表明，高脂飲食可顯著破壞小鼠的脂質(zhì)代謝能力[2]；魚類中的研究也發(fā)現(xiàn)，高脂日糧對(duì)鯉魚肌肉中粗蛋白含量無顯著影響，但對(duì)粗脂肪含量的影響則相反，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，飼料中適量降低蛋白質(zhì)、添加脂肪可以促進(jìn)鯉魚生長，降低飼料成本[3]。此外，高脂食物飼喂導(dǎo)致小鼠結(jié)腸屏障功能受損、腸道微生物菌群失調(diào)[4]，進(jìn)而引起代謝紊亂和疾病的發(fā)生。

作為“四大家魚”之一，草魚（Ctenopharyngodon idellus）是我國主要的養(yǎng)殖魚類，由于其養(yǎng)殖成本低、養(yǎng)殖技術(shù)完善、成活率高等特點(diǎn)，廣受漁民青睞。2017年以來，我國草魚養(yǎng)殖產(chǎn)量逐年遞增，2020年達(dá)到了5.57×103kt[5]。為了探究高脂食物對(duì)草魚幼魚的影響，本研究以草魚幼魚（10.22±0.10 g）為研究對(duì)象，設(shè)置對(duì)照組和高脂組共兩組實(shí)驗(yàn)，養(yǎng)殖草魚8周后，分別對(duì)草魚的生長性能、血清生化指標(biāo)、肝臟脂肪蓄積、不同組織脂肪酸成分及腸道微生物進(jìn)行檢測(cè)，以期闡明高脂飼料對(duì)草魚營養(yǎng)成分、脂肪蓄積和腸道微生物菌群等的綜合影響，為草魚飼料配方優(yōu)化、營養(yǎng)品質(zhì)改良等提供借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)魚和飼料

本實(shí)驗(yàn)草魚均購自鄭州市金水區(qū)興達(dá)水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)，在河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院養(yǎng)殖基地馴養(yǎng)兩周，然后選取120尾初始體重為10.22±0.10 g的健康的幼草魚，隨機(jī)分為兩個(gè)組，每組設(shè)置三個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20尾。正式養(yǎng)殖8周，每天飼喂三次，時(shí)間為8:00、12:00和18:00，整個(gè)養(yǎng)殖期間保證光照周期為12 L:12 D，溫度保持在23±1℃。采樣前禁食24 h。

配置兩組等蛋白的飼料，其中對(duì)照組脂質(zhì)含量為2%（實(shí)測(cè)值為2.53±0.38%），試驗(yàn)組脂質(zhì)含量為6%（實(shí)測(cè)值為5.97±0.88%），用魚油和大豆油作為高脂添加源，其他成分兩組保持一致（表1）。

表1 飼料配方及營養(yǎng)成分組成

1.2 樣品收集

養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，樣本采集前，用MS-222（100 mg/L）對(duì)草魚進(jìn)行麻醉處理，然后對(duì)體表進(jìn)行消毒并測(cè)量其體長；每桶隨機(jī)取3條魚進(jìn)行解剖，取其肝臟、腸道、肌肉液氮速凍，然后置于-80℃中保存，之后冷凍干燥24 h，研磨粉碎，用于脂肪酸成分測(cè)定；另外，每桶隨機(jī)取3條魚，進(jìn)行腹部解剖，取肝臟用于切片的制作，并解剖腸壁，取腸道內(nèi)容物，用于腸道微生物檢測(cè)。

1.3 生長性能測(cè)定

各生長指標(biāo)計(jì)算公式如下：

增重率WGR/%=（Wt-Wo）/Wo×100

特定生長率SGR/%=[Ln Wt-Ln Wo]/(d)×100

飼料系數(shù)FCR=F/（Wt-Wo）

臟體指數(shù)VSI/%=Wv/Wt×100

肝胰指數(shù)HIS/%=WL/Wt×100

肥滿度CF/（g/cm3）= Wt/ L3×100

存活率SR/%=成活尾數(shù)/總尾數(shù)×100

式中—Wt末體質(zhì)量（g），Wo初體質(zhì)量（g），d飼養(yǎng)天數(shù)，F(xiàn)飼料消耗量（g），Wv內(nèi)臟重（g），WL肝胰重（g），L體長（cm）

1.4 血清生化指標(biāo)檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，分別從對(duì)照組和試驗(yàn)組隨機(jī)挑選6尾草魚進(jìn)行尾靜脈采取血液，放在常溫下靜置30分鐘，于4℃冰箱中放置3小時(shí)，4℃、3000 rpm離心15分鐘，分層后取上清液，將其置于-80℃的冰箱內(nèi)保存，各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)方法參考試劑盒說明 （均購買自南京建成生物工程研究所）。

1.5 脂肪酸成分分析

按照課題組已發(fā)表文章方法[6]，稱取3.0 g左右的樣品，用氯仿/甲醇(2:1)溶液萃取組織中脂質(zhì)，使用美國Agilent 7890B氣相色譜儀測(cè)定肝臟、腸道和肌肉中的脂肪酸成分，采用百分比的方法計(jì)算組織中脂肪酸含量。

1.6 肝臟組織切片

取適當(dāng)?shù)母闻K，用4%多聚甲醛固定24 h，對(duì)草魚肝臟組織樣品進(jìn)行石蠟包埋、切片，并用蘇木精-伊紅（HE）染色和油紅染色，于顯微鏡下對(duì)草魚肝臟形態(tài)的變化進(jìn)行觀察和拍照。

1.7 微生物組測(cè)序

按照試劑盒（Takara）使用說明書提取腸道微生物組DNA，使用紫外分光光度計(jì)（nanodrop）測(cè)定腸道微生物組DNA濃度。實(shí)驗(yàn)以V3-V4區(qū)通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增[7]，經(jīng)純化和定量后，送至檢測(cè)公司（美吉生物）進(jìn)行高通量測(cè)序及測(cè)序結(jié)果生物信息學(xué)分析。本實(shí)驗(yàn)共構(gòu)建6個(gè)測(cè)序文庫，其中對(duì)照組3個(gè)平行（C-1、C-2、C-3），試驗(yàn)組3個(gè)平行（T-1、T-2、T-3）。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用Excel 2010對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各項(xiàng)指標(biāo)對(duì)應(yīng)的數(shù)值運(yùn)用SPASS 22.0進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05視為存在顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 高脂飼料對(duì)草魚生長性能的影響

飼喂8周之后，分析草魚生長性能指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組草魚的增重率和特定生長率高于對(duì)照組；而試驗(yàn)組飼料系數(shù)、臟體指數(shù)、肝胰指數(shù)和肥滿度均低于對(duì)照組，其中肝胰指數(shù)和肥滿度具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）（表2）。

表2 草魚生長性能和生物學(xué)指標(biāo)

已有研究表明適當(dāng)提高飼料中的脂質(zhì)含量可以促進(jìn)魚類的生長[8,9]。但本研究中草魚的生長性能差異不顯著，這可能是由于養(yǎng)殖系統(tǒng)不完善等環(huán)境因素造成的。比如，本研究使用的簡易養(yǎng)殖系統(tǒng)沒有自動(dòng)殺菌、水體清潔及過濾等功能，實(shí)驗(yàn)過程中，為了保證水體質(zhì)量，每天更換桶內(nèi)1/3的養(yǎng)殖水，頻繁的換水會(huì)造成魚體應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致攝食下降，由此可能會(huì)對(duì)魚正常生長帶來不利影響。此外，也有研究表明，在飼料中添加不同種類的脂肪源，草魚的生長程度不同，說明不同脂肪源對(duì)草魚的生長性能有不同的影響[10]。

2.2 高脂飼料對(duì)草魚常規(guī)生理生化指標(biāo)的影響

試驗(yàn)組草魚血清中TG含量顯著低于對(duì)照組。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)組草魚的TC、ALT、LDL-C、MDA、CAT、TAOC和T-SOD含量顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)（表3）。

TG是血脂的主要成分之一，在動(dòng)物機(jī)體中具有存儲(chǔ)能源物質(zhì)、保護(hù)機(jī)體臟器的作用。但是過量的TG是常見代謝性疾病的成因之一。在本實(shí)驗(yàn)中，試驗(yàn)組的TG含量降低，可能是我們使用的魚油當(dāng)中含有多聚不飽和脂肪酸，多聚不飽和脂肪酸可促進(jìn)魚體的生長發(fā)育并且可以降低過多的TG的含量，因此在試驗(yàn)組草魚TG的含量會(huì)降低。同時(shí)，已有研究也發(fā)現(xiàn)隨著草魚飼喂高脂飼料時(shí)間的增加，草魚體內(nèi)的各項(xiàng)生化指標(biāo)（TC、ALT、ALT、MDA、T-SOD和CAT）的水平普遍顯著升高(P＜0.01)[11]，與本實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果一致。

2.3 高脂對(duì)草魚肝胰臟脂肪蓄積的影響

觀察HE切片發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組肝細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞核位于近中央位置，但試驗(yàn)組肝細(xì)胞脂質(zhì)空泡增大，且細(xì)胞變形。與之類似，油紅切片顯示，試驗(yàn)組草魚肝細(xì)胞中脂滴的數(shù)量和大小顯著大于對(duì)照組。說明高脂食物飼喂草魚可增加草魚肝胰臟中脂肪的蓄積（圖1）。

圖1 草魚肝胰臟HE染色切片及油紅染色切片標(biāo)尺：50μm

眾多研究發(fā)現(xiàn)，在高脂飼料的長期脅迫下，草魚的肝胰臟代謝紊亂，且肝胰臟組織也有脂肪的蓄積，從而出現(xiàn)病理上的損傷[12,13]。同時(shí)，黃春紅[14]對(duì)草魚的研究發(fā)現(xiàn)，肝胰臟的部分基因會(huì)隨著肝胰臟脂肪含量的增加而增多，而機(jī)體內(nèi)關(guān)于脂肪的分解的過程被慢慢阻止，脂肪合成的路徑活躍，這可能也是肝胰臟的脂肪蓄積的原因之一。與之類似，本實(shí)驗(yàn)研究肝胰臟細(xì)胞脂肪的蓄積增加，但具體的分子機(jī)制還需要作進(jìn)一步的研究。

2.4 高脂飼料對(duì)草魚脂代謝關(guān)鍵組織脂肪酸成分的影響

肌肉是脂肪酸蓄積的主要組織，其脂肪酸成分主要由肝臟和腸道轉(zhuǎn)運(yùn)而來，肌肉內(nèi)的脂肪酸組成直接反應(yīng)了魚體的營養(yǎng)價(jià)值。因此，本實(shí)驗(yàn)分析了對(duì)照組和試驗(yàn)組草魚肌肉、腸道和肝臟中的脂肪酸組成及含量（表4）。

表4 草魚肝臟、腸道、肌肉脂肪酸組成

試驗(yàn)組草魚肌肉中C16:1、C18:1和C20:1等單不飽和脂肪酸 （MUFA）的含量均顯著低于對(duì)照組 （P＜0.05）；試驗(yàn)組EPA的含量顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）；試驗(yàn)組飽和脂肪酸（∑SA）含量顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），而多不飽和脂肪酸（∑PUFA）和∑PUFA/∑SA的含量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。草魚腸道中∑SA、∑PUFA和∑PUFA/∑SA的變化趨勢(shì)和肌肉中相同。試驗(yàn)組草魚肝臟內(nèi)∑SA和∑ω-3含量顯著低于對(duì)照組，而∑ω-6含量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；同時(shí)，試驗(yàn)組肝臟中C18: 2n6和C18: 3n3的含量顯著高于對(duì)照組，而C20: 3n6、C20:4n6和C22:6n3的變化趨勢(shì)與之相反（P＜0.05）。

綜上，在草魚肝臟、肌肉和腸道中，試驗(yàn)組∑SA含量顯著降低；而C18: 2n6和C18: 3n3等PUFA含量顯著增加（P＜0.05）。韓光明等[11]在研究中發(fā)現(xiàn)，隨著飼料中脂肪水平提高，肌肉中∑PUFA含量顯著升高，這與Wang[12]等對(duì)中華絨螯蟹的研究、Gao[13]等對(duì)泥鰍的研究和Xu[14]等對(duì)青蟹的研究結(jié)果是一致的，本研究結(jié)果與上述結(jié)果一致。同時(shí)，本研究中高脂組主要是增加大豆油和魚油的含量來提高脂肪含量，而大豆油中亞油酸含量高達(dá)50%-60%[15]，魚油中的∑PUFA尤其是EPA和DHA含量也較高[16]，因此，本研究中草魚肌肉、腸道和肝臟中不飽和脂肪酸含量的顯著性增加可能是由于高脂飼料中大豆油的亞油酸含量過高以及魚油中∑PUFA含量較高造成的。

2.5 高脂食物對(duì)草魚腸道微生物菌群的影響

本實(shí)驗(yàn)共共得到333919條高質(zhì)量序列，平均每一個(gè)樣本測(cè)序量為55653條序列（表5）。大多數(shù)序列長度在410-420 bp之間，也有一部分序列為420-440 bp之間。

表5 16S rRNA高通量測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

統(tǒng)計(jì)樣品中的OTU數(shù)目及其對(duì)應(yīng)比例，構(gòu)建OTU豐度曲線（Rank-abundance曲線），發(fā)現(xiàn)OTU豐度曲線平滑下降，表明樣本的物種多樣性高（圖2 A）。從測(cè)序深度來看，coverage指數(shù)趨近于1（圖2 B），表明測(cè)序結(jié)果能反映樣本的實(shí)際結(jié)果。試驗(yàn)組OTU水平香濃指數(shù)比對(duì)照組高，但差距不大。說明本次測(cè)序的質(zhì)量比較好，可以代表送樣樣本腸道微生物菌群的普遍情況。

從OTU水平分析來看，試驗(yàn)組的OTU數(shù)量多于對(duì)照組，且試驗(yàn)組的腸道菌群的群落多樣性較高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖2 C）；試驗(yàn)組與對(duì)照組共有595個(gè)重復(fù)OTU，試驗(yàn)組有135個(gè)獨(dú)特的OTU，而對(duì)照組有194個(gè)獨(dú)有的OTU（圖2 D）。

圖2 Rank-abundance曲線（A）覆蓋率指數(shù)圖（B）香濃指數(shù)分析（C）維恩圖（D）

從菌種分析來看，對(duì)照組中變形菌門（42%）、梭桿菌門（15%）和擬桿菌門（17%）為優(yōu)勢(shì)菌群，實(shí)驗(yàn)組中的優(yōu)勢(shì)菌群為變形菌門（61%）和放線菌門（13%）（圖3 A）。PCA分析發(fā)現(xiàn)（圖3 B），C-2/C-3以及T1/T3呈現(xiàn)聚集分布的特點(diǎn)。軼和檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組在變形菌、放線菌、梭桿菌和擬桿菌上均有含量變化，但差異具有不顯著性（P＞0.05）（圖3 C）。這可能是對(duì)照組中C-1樣本差異太大造成的，具體的原因仍需在未來的研究中進(jìn)一步深入闡明。

圖3 樣本間菌種差異分析（A）PCA分析（B）軼和檢測(cè)分析圖（C）

變形菌具有碳的代謝功能，與食物消化吸收有關(guān)，其次還具有降解角蛋白的功能[17]。變形菌作為對(duì)照組與試驗(yàn)組共有的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群，其益生作用體現(xiàn)較為明顯。梭桿菌為對(duì)照組的優(yōu)勢(shì)菌群，它是一類極具潛力的魚類土著益生菌，梭桿菌門豐度的高低與魚體健康狀態(tài)存在顯著關(guān)聯(lián)[18]。若機(jī)體受到外來病毒攻擊時(shí)，梭桿菌的數(shù)量和豐度就會(huì)明顯下降。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也印證了試驗(yàn)組草魚腸道中梭桿菌的含量遠(yuǎn)低于對(duì)照組，推測(cè)在高脂食物添加的情況下，由于各種代謝性疾病或其他原因?qū)е卖~體免疫力降低，從而使?jié)撛诓《净蛲鈦聿《厩秩爵~體進(jìn)而導(dǎo)致梭桿菌數(shù)量降低。

4 結(jié)論

飼料中脂肪含量為6%時(shí)，草魚的生長性能并未出現(xiàn)顯著變化，肝臟脂肪蓄積顯著增加，但肝臟、肌肉和腸道中∑SA含量顯著降低，而∑PUFA含量顯著增加(P＜0.05)，在一定程度上提升了草魚肌肉品質(zhì)。與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組草魚在腸道微生物菌群數(shù)量上無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。上述研究結(jié)果可為草魚的健康養(yǎng)殖提供依據(jù)，但高脂食物對(duì)草魚脂肪酸組成及腸道菌群的具體影響機(jī)制在未來的研究中仍需深入闡明。