基于Notch1通路探討蒼術酮對肝癌細胞化療耐藥的作用機制研究*

唐 凌，陳 莉，張 聰

（1.樂山市中醫醫院，四川 樂山 614000；2.成都中醫藥大學附屬醫院，四川 成都 614000）

原發性肝癌是全球第六大常見癌癥，也是全球癌癥死亡的第二大常見原因[1]。手術治療是早期肝癌的有效治療手段，但大部分患者確診時已是中晚期，故化療一直是肝癌首選的臨床治療方法。然而化療藥物的組織特異性差[2]，若發生肝癌細胞耐藥則會限制其治療效果，并導致轉移且預后不良[3]。因此積極探索肝癌化療耐藥的分子機制以尋找更有效的治療靶點，對改善肝癌預后具有重要意義。Notch信號通路是一種高度保守的細胞信號系統，在調節細胞間接觸、細胞存活、細胞增殖、細胞分化及多種生理過程中發揮著至關重要的作用。Notch1通路已被證明是多種癌癥中的關鍵調節因子[4-5]，提示該通路可能與肝癌細胞化療耐藥進展相關。蒼術酮是一種從中藥蒼術、白術中分離出的倍半萜類化合物，具有多種藥理活性[6]。研究[7]發現其可通過降低線粒體膜電位，增加細胞內活性氧水平，誘導肝癌細胞凋亡，但關于其是否可介導Notch1通路調節肝癌細胞的化療敏感性尚待探究。故本研究擬體外培養人肝癌耐藥細胞株Bel/Fu，使用蒼術酮干預，觀察細胞存活、凋亡、侵襲情況，并檢測細胞內相關因子表達水平，以期為肝癌化療耐藥干預靶點及藥物選擇提供一定的參考。

1 材 料

1.1 細胞系 人肝癌氟尿嘧啶耐藥細胞株Bel/Fu購自通派（上海）生物科技有限公司。

1.2 試劑 蒼術酮（純度≥98%）（批號：PCS1052）購自成都植標化純生物技術有限公司；5-氟尿嘧啶（批號：2352C062）購自上海艾研生物科技有限公司；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒（批號：C1062L）購自上海碧云天生物技術有限公司；Matrigel基質膠（批號：356234）購自上海碩嘉生物科技有限公司；Invitrogen TRIzol試劑（批號：1382737）購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；BCA試劑盒（批號：20190325）購自江蘇凱基生物技術股份有限公司；ECL發光液（批號：70120200）購自biosharp生物科技公司；P糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）（批號：6970-100）、多藥耐藥相關蛋白1（multiple resistance protein-1，MRP1）（批號：CAU32198）均購自武漢艾美捷科技有限公司；Notch1抗體（批號：ab167441）、Hes1抗體（批號：ab71559）、Jagged1抗體（批號：ab7771）、B細胞淋巴瘤/白血病-2基因（B cell lymphoma/leukemia-2 gene，Bcl-2）抗體（批號：ab182858）、Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）（批號：ab32503）抗體均購自美國Abcam公司。

1.3 主要儀器 Gentier 96E實時熒光定量PCR系統（西安天隆科技有限公司）；MultiskanTMFC多功能酶標儀（美國賽默飛世爾科技有限公司）；Gel Doc XR+凝膠成像分析系統（美國Bio-Rad公司）。

2 方 法

2.1 細胞培養 RPMI 1640完全培養液（含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素）復蘇細胞，置于37 ℃、體積分數為5%CO2及飽和濕度環境條件下的培養箱中培養，每2d換液1次，細胞密度增至85%以上時進行傳代，傳代2～3次。

2.2 CCK8法檢測不同濃度蒼術酮對Bel/Fu細胞的增殖抑制作用 取對數生長期細胞，胰酶消化并離心，收集細胞沉淀，并分為對照組、4 μmol/L蒼術酮組、8 μmol/L蒼術酮組、16 μmol/L蒼術酮組、32 μmol/L蒼術酮組、64 μmol/L蒼術酮組。其中對照組培養液為RPMI 1640完全培養液，各濃度蒼術酮組培養液分別為RPMI 1640完全培養液+（4、8、16、32、64 μmol/L）蒼術酮。利用對應培養液重懸細胞并接種100μL至96孔板（1×104個/孔），每個濃度各5個復孔，連續培養48 h。后于各孔內直接加入10 μL CCK8試劑，孵育2 h后利用全自動酶標儀測定450 nm處的吸光度（OD）值，細胞存活率（%）=蒼術酮作用組OD值/對照組OD值×100%。重復3次。

2.3 細胞分組與培養 取對數生長期的Bel/Fu細胞，胰酶消化并離心，收集細胞沉淀，分為空白組、5-氟尿嘧啶組、蒼術酮組及聯合組，其中空白組培養液為RPMI 1640完全培養液，5-氟尿嘧啶組、蒼術酮組及聯合組細胞培養液中分別添加5-氟尿嘧啶（20 μmol/L）、蒼術酮（32 μmol/L）、5-氟尿嘧啶（20 μmol/L）+蒼術酮（32 μmol/L）。

2.4 CCK8法檢測各組細胞存活率 利用對應培養液重懸細胞并接種100 μL至96孔板（1×104個/孔），每個濃度各5個復孔，連續培養48 h。后于各孔內直接加入10 μL CCK8試劑，孵育2 h后利用全自動酶標儀測定450 nm處的吸光度（OD）值，細胞存活率（%）=實驗組OD值/空白組OD值×100%。此處實驗組分別為5-氟尿嘧啶組、蒼術酮組及聯合組。重復3次，鏡下觀察并拍照記錄各組細胞形態。

2.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡率 對應培養液培養48 h后，收集細胞，PBS洗滌2次后1 000 r/min離心5 min，取細胞沉淀，70%乙醇4 ℃固定過夜。離心收集細胞，預冷PBS洗滌2次，結合緩沖液重懸，Annexin V-FITC溶液和PI溶液避光孵育20 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。重復3次。

2.6 Transwell實驗檢測細胞侵襲能力 事先涂布Matrigel基質膠于Transwell 24孔板上室，并于每孔接種2×104個細胞，下室加入500 μL各組對應培養液（去除胎牛血清），48 h后，100%甲醇固定Transwell下側侵入細胞20 min，0.1%結晶紫染色30 min，鏡下觀察并拍照、計數。重復3次。

2.7 RT-qPCR技術檢測P-gp mRNA、MRP1 mRNA相對表達量 各組對應培養液培養48 h后，Trizol法提取各組細胞總RNA，檢測RNA完整性及純度，合格后將其反轉錄為cDNA，并于實時熒光定量PCR儀內進行定量檢測，反應條件為94 ℃30s，60℃30 s，72 ℃1 min，30個循環，72 ℃10 min。以β-actin為內參基因，2-ΔΔCt法計算靶基因的相對表達量。引物序列：P -gp：F:5' -TGATTGCATTTGGAGGACAA -3'，R：5' -CCAGAAGGCCAGAG CATAAG-3'；MRP1：F：5'-AGGTGGACCTGTTTCGTGAC-3'，R：5'-CCTGTGATCCACCAGAAGGT-3'；βactin：F：5'-CATGGAGTCCTGTGGCATC-3'，R：5'-CAGGGCAG TGATCTCCTTCT-3'。重復3次。

2.8 Western blotting法檢測通路、凋亡及化療耐藥相關蛋白相對表達情況 各組對應培養液培養48 h后，預冷RIPA裂解緩沖液提取各組細胞全蛋白，BCA法測定蛋白濃度，加熱變性蛋白，SDS-PAGE電泳凝膠分離蛋白，并濕轉至PVDF膜上，1×TBST洗膜3次，后于5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，一抗（1∶1 000稀釋）內4 ℃孵育過夜；次日，1×TBST洗膜3次，二抗（1∶10 000稀釋）內室溫孵育2 h，1×TBST洗膜3次，ECL發光液顯色，凝膠成像分析系統曝光，Image J分析條帶灰度值，以目的蛋白P-gp、MRP1、Notch1、Hes1、Jagged1、Bcl-2、Bax與內參β-actin灰度值比值表示蛋白相對表達量。重復3次。

2.9 統計學方法 采用SPSS 26.0軟件進行數據統計學處理，計量資料均以“均數±標準差”（±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

3結 果

3.1 不同濃度蒼術酮處理下各組細胞存活率比較 細胞存活率隨蒼術酮濃度增大而降低（P<0.05）。當蒼術酮作用濃度為32 μmol/L時，細胞存活率接近50%。故選擇32 μmol/L蒼術酮進行后續實驗。（見圖1）

圖1 不同濃度蒼術酮處理下各組細胞存活率比較（±s，n=3）

3.2 各組細胞形態學觀察 培養48 h后，鏡下可見空白組細胞密度較大，呈梭形或卵圓形，排列規則，結構完整；5-氟尿嘧啶組細胞大部分呈長梭，結構完整，僅見少量死亡細胞；蒼術酮組細胞密度小，細胞變大、形狀不一，呈扁平貼壁狀；聯合組細胞凋亡嚴重，見大量細胞空泡化、壞死，核濃縮或崩解。（見圖2）

圖2 光鏡下各組細胞形態圖（×100）

3.3 各組細胞存活率比較 5-氟尿嘧啶組細胞存活率與空白組比較，差異無統計學意義（P>0.05）；與5-氟尿嘧啶組比較，蒼術酮組及聯合組細胞存活率明顯降低（P<0.05）；與蒼術酮組比較，聯合組細胞存活率明顯降低（P<0.05）。（見表2）

表2 各組細胞存活率比較 （±s）

表2 各組細胞存活率比較 （±s）

注：與空白組比較，aP<0.05；與5-氟尿嘧啶組比較，bP<0.05；與蒼術酮組比較，cP<0.05

組別 n 細胞存活率（%）空白組 3 100.00±0.00 5-氟尿嘧啶組 3 97.70±1.97蒼術酮組 3 53.57±3.02a b聯合組 3 42.73±2.63a b c F 528.539 P 0.000

3.4 各組細胞凋亡率比較 5-氟尿嘧啶組細胞凋亡率與空白組比較，差異無統計學意義（P>0.05）；與5-氟尿嘧啶組比較，蒼術酮組及聯合組細胞凋亡率明顯升高（P<0.05）；與蒼術酮組比較，聯合組細胞凋亡率明顯升高（P<0.05）。（見圖3、表3）

圖3 流式細胞術檢測各組細胞凋亡情況

表3 各組細胞凋亡率比較 （±s）

表3 各組細胞凋亡率比較 （±s）

注：與空白組比較，aP<0.05；與5-氟尿嘧啶組比較，bP<0.05；與蒼術酮組比較，cP<0.05

組別 n 細胞凋亡率（%）空白組 3 2.19±0.25 5-氟尿嘧啶組 3 2.81±0.33蒼術酮組 3 25.40±1.94a b聯合組 3 37.75±2.13a b c F 435.231 P 0.000

3.5 各組細胞侵襲情況比較 5-氟尿嘧啶組細胞侵襲數量與空白組比較，差異無統計學意義（P>0.05）；與5-氟尿嘧啶組比較，蒼術酮組及聯合組細胞侵襲數明顯降低（P<0.05）；與蒼術酮組比較，聯合組細胞侵襲數明顯降低（P<0.05）。（見圖4、表4）

圖4 各組細胞侵襲情況（×400）

表4 各組細胞侵襲數量比較 （±s）

表4 各組細胞侵襲數量比較 （±s）

注：與空白組比較，aP<0.05；與5-氟尿嘧啶組比較，bP<0.05；與蒼術酮組比較，cP<0.05

組別 n 細胞侵襲數（個）空白組 3 201.33±15.82 5-氟尿嘧啶組 3 189.67±11.02蒼術酮組 3 101.33±12.90a b聯合組 3 61.33±11.02a b c F 84.315 P 0.000

3.6 各組Bel/Fu細胞P-gp mRNA、MRP1 mRNA相對表達量比較 5-氟尿嘧啶組細胞P-gp mRNA、MRP1 mRNA相對表達量與空白組比較，差異無統計學意義（P>0.05）；與5-氟尿嘧啶組比較，蒼術酮組及聯合組細胞P-gp mRNA、MRP1 mRNA相對表達量明顯降低（P<0.05）；與蒼術酮組比較，聯合組細胞P-gp mRNA、MRP1 mRNA相對表達量明顯降低（P<0.05）。（見表5）

表5 各組細胞P-gp mRNA、MRP1 mRNA 相對表達量比較（±s）

表5 各組細胞P-gp mRNA、MRP1 mRNA 相對表達量比較（±s）

注：與空白組比較，aP<0.05；與5-氟尿嘧啶組比較，bP<0.05；與蒼術酮組比較，cP<0.05

組別 n P-gp mRNA MRP1 mRNA空白組 3 1.00±0.02 1.00±0.01 5-氟尿嘧啶組 3 0.95±0.03 0.97±0.03蒼術酮組 3 0.71±0.04a b 0.67±0.06a b聯合組 3 0.37±0.03a b c 0.42±0.05a b c F 261.342 126.930 P 0.000 0.000

3.7 各組細胞Notch1通路、凋亡及化療耐藥相關蛋白相對表達量比較 5-氟尿嘧啶組細胞中P-gp、MRP1、Notch1、Hes1、Jagged1、Bcl-2、Bax蛋白相對表達量與空白組比較，差異無統計學意義（P>0.05）；與5-氟尿嘧啶組比較，蒼術酮組及聯合組細胞P-gp、MRP1、Notch1、Hes1、Jagged1、Bcl-2蛋白相對表達量均明顯降低，Bax蛋白相對表達量明顯升高（P<0.05）；與蒼術酮組比較，聯合組細胞P-gp、MRP1、Notch1、Hes1、Jagged1、Bcl-2蛋白相對表達量明顯降低，Bax蛋白相對表達量明顯升高（P<0.05）。（見圖5、表6）

表6 各組細胞相關蛋白相對表達量比較 （±s，n=3）

表6 各組細胞相關蛋白相對表達量比較 （±s，n=3）

注：與空白組比較，aP<0.05；與5-氟尿嘧啶組比較，bP<0.05；與蒼術酮組比較，cP<0.05

組別 P-gp MRP1 Notch1 Hes1 Jagged1 Bcl-2 Bax空白組 0.67±0.05 0.71±0.07 0.24±0.03 0.38±0.04 0.63±0.07 0.43±0.05 0.23±0.02 5-氟尿嘧啶組 0.58±0.06 0.63±0.06 0.21±0.04 0.35±0.05 0.59±0.06 0.41±0.04 0.22±0.03蒼術酮組 0.29±0.04a b 0.20±0.03a b 0.15±0.02a b 0.26±0.02a b 0.28±0.03a b 0.24±0.01a b 0.34±0.02a b聯合組 0.08±0.01a b c 0.12±0.01a b c 0.10±0.01a b c 0.14±0.02a b c 0.17±0.01a b c 0.18±0.01a b c 0.64±0.04a b c F 112.667 112.211 15.600 28.469 65.295 42.884 139.727 P 0.000 0.000 0.001 0.000 0.000 0.000 0.000

圖5 各組細胞相關蛋白表達Western blotting 圖

4 討 論

5-氟尿嘧啶是一種抗癌藥物，被用作肝癌治療的標準化療藥物之一。其在高濃度下可獲得耐藥性和細胞毒性，致使其治療效果較弱[8]，故研究肝癌細胞耐藥性機制和治療策略以逆轉耐藥性和使癌細胞對5-氟尿嘧啶再敏感至關重要。中醫藥治療腫瘤療效確切，可抑制腫瘤生長、提高患者生存質量、減輕臨床癥狀。據報道，中西醫聯合治療可減少西藥毒副作用、降低術后復發率、延緩病情進展，對防治腫瘤作用顯著[9-10]。蒼術酮為臨床常用抗腫瘤中藥白術的主要成分之一。研究發現，蒼術酮具有一定的體內抗腫瘤效應[11]，可抑制肝癌細胞HepG2活力和遷移，影響細胞正常形態結構、生長并促進細胞凋亡[7,12]。本研究采用體外培養人肝癌氟尿嘧啶耐藥細胞株Bel/Fu，并利用蒼術酮干預。結果顯示：細胞存活率呈劑量依賴性降低，提示蒼術酮可抑制肝癌細胞化療耐藥株細胞增殖；另經聯合應用后，與5-氟脲嘧啶組比較，聯合組細胞存活率、侵襲數量顯著降低，細胞凋亡率顯著升高，且鏡下細胞形態變形，結構可見有損傷，說明蒼術酮可增強5-氟尿嘧啶的化療敏感性。

多藥耐藥是腫瘤化療失敗的最常見原因，耐藥性與ATP結合盒蛋白家族藥物轉運蛋白的過表達有關，包括多藥耐藥性1基因及其編碼產物P-gp、MRP等[13]。P-gp是一種跨膜蛋白，可將藥物排出體外，降低藥物在細胞內的生物利用度，從而降低藥物抗癌的功效。P-gp可保護耐藥細胞免受自由基、輻射和細胞毒藥物誘導的各種形式的半胱天冬酶依賴性細胞凋亡的影響，延緩細胞凋亡級聯反應，在分子水平上建立腫瘤抗性和細胞凋亡耐受性之間的有機聯系[14]。MRP1也稱為ABCC1，為ATP結合盒轉運蛋白超家族的成員。其表達下調可逆轉化療耐壓癌細胞的耐藥性[15]，MRP1MRP1/ABCC1的過表達預示著SCLC對化療的不良反應[16]。SUN Z等[17]研究表明，P-gp可促進耐多藥肝癌HepG2/ADM細胞系多藥耐藥發展。ZHOU Y等[18]研究發現，多重耐藥人肝癌細胞株SK-Hep1/順鉑中P-gp、MRP1蛋白相對表達量顯著高于SK-Hep1。LI S等[19]研究顯示，P-gp和MRP1的表達抑制可增加由丙型肝炎病毒感染的人類肝癌Huh7.5.1細胞對5-氟尿嘧啶的敏感性。本研究結果顯示，與5-氟尿嘧啶組比較，蒼術酮單獨作用、蒼術酮聯合5-氟尿嘧啶作用Bel/Fu細胞后，細胞中P-gp、MRP1的mRNA和蛋白相對表達量均降低，且聯合應用后效果更顯著，提示蒼術酮可通過抑制耐藥相關蛋白表達提高藥物在細胞內的生物利用度及細胞凋亡級聯反應，進而增強肝癌細胞對5-氟尿嘧啶的化療敏感性。

肝癌細胞耐藥機制復雜，包括識別和泵出腫瘤細胞抗癌藥物的藥物外排轉運蛋白表達增加、藥物在細胞內積聚的重新分布、細胞凋亡信號通路的失活等[20]。到目前為止，HCC耐藥性的確切機制仍有待研究。抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax是Bcl-2家族的兩種代表性蛋白，Bax和Bcl-2在正常細胞中形成二聚體且表達相對穩定。當Bax表達增加而Bcl-2表達減少時，兩者之間平衡被打破，可誘導細胞凋亡[21]。Notch1通路是一種細胞-細胞間的通信機制，由細胞膜結合的Notch受體與其配體（如Jagged1～2）在并列細胞上相互作用而激活。質膜上釋放Notch胞內結構域進入細胞核，與CSL轉錄因子及共激活因子形成復合體可促進Notch靶基因如Hes、Hey的轉錄，在調節增殖、凋亡/生存中發揮重要作用[22]。ZHOU J等[23]研究發現，抑制Notch1/Hes1信號通路可增強人胃癌細胞皮下異種移植模型對5-氟尿嘧啶的化學敏感性，此時Bax表達上調，Bcl-2表達下調，細胞凋亡增加。LI N N等[24]研究表明，轉染Notch1 siRNA可下調MRP1表達和活性。另有研究顯示，Notch1敲低可導致P-gp和MRP1表達水平降低，抑制人肝內膽管癌細胞的增殖和侵襲，并增加其體外對5-氟尿嘧啶的敏感性[25]。本研究結果顯示，蒼術酮單獨作用Bel/Fu時，可顯著降低Notch1、Hes1、Jagged1及Bcl-2蛋白相對表達量并上調Bax蛋白相對表達量，且5-氟尿嘧啶聯合蒼術酮后，細胞內Notch1、Hes1、Jagged1及Bcl-2蛋白相對蛋白相對表達量量下調或Bax表達上調更為顯著，提示蒼術酮可能通過抑制Notch1通路激活降低耐藥相關蛋白P-gp和MRP1及抗凋亡蛋白Bcl-2表達，提高促凋亡蛋白Bax表達，進而增強肝癌細胞對5-氟尿嘧啶的化療敏感性。

綜上所述，蒼術酮可提高細胞凋亡率，降低細胞存活及侵襲能力，增強肝癌細胞對5-氟尿嘧啶的化療敏感性，其作用機制可能與抑制Notch1通路激活有關。