基于網絡藥理學探討毒結清復方對多發性骨髓瘤的作用機制及實驗驗證*

雷 宇，郭一慧，許家威，程緯民，何 艾，曾 清，陸海頌

（1.廣西中醫藥大學第一附屬醫院，廣西 南寧 530023；2.廣西中醫藥大學研究生院，廣西 南寧 530001）

多發性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是一種以骨髓中單克隆漿細胞惡性增殖為特征的漿細胞疾病，其主要臨床表現為骨痛、骨質破壞、腎功能不全、高鈣血癥及貧血[1]。MM發病率在世界范圍內呈上升趨勢，目前估計全球發病率為7/10萬，比1975年增加143%。隨著免疫調節劑、蛋白酶體抑制劑、抗體類、具有新型作用機制的靶向藥物及嵌合抗原受體T細胞（CAR-T）等治療手段的普及，患者的生存期顯著延長，MM中位生存期現為7～10年[2]。由于醫療費用高昂，臨床患者仍多選擇多次長期誘導化療及對癥治療，隨之而來的毒副作用、易復發、療效不理想等問題常使療程受到中斷[3-4]。我們迫切需要開發療效確切并且毒副作用小的中藥復方來減輕治療毒副反應，從而達到改善患者預后的目的。基于中醫“扶正祛邪”“標本兼治”理論開發的毒結清復方，是廣西中醫藥大學第一附屬醫院根據多年治療腫瘤的臨床經驗并結合當地醫家治療癌病的驗方制成的院內制劑。該制劑具有化瘀毒、散癌結、益氣陰、健脾腎之功效。臨床研究[5-6]發現，毒結清復方可較好地改善骨髓瘤患者的骨痛癥狀。基礎研究[7-8]發現，除治療骨髓瘤外，毒結清復方還可以通過去甲基化來抑制肺癌小鼠體內腫瘤的增殖。因此，考慮毒結清具有多靶點、多通路抑制腫瘤細胞增殖的機制。本研究基于網絡藥理學及實驗驗證探討毒結清復方治療MM的機制，旨在為臨床應用提供理論依據。

1 材 料

1.1 數據庫與軟件 （1）中藥系統藥理數據庫和分析平臺（TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php）；（2）高通量中藥實驗和參考數據庫（本草組鑒，https://www.herb.ac.cn）；（3）UniProt全球蛋白資源數據庫（UniProt，https://www.uniprot.org/）；人類基因數據庫（GeneCards，https://www.genecards.org）；（4）功能蛋白結合網絡數據庫（String，https://www.string-db.org）；（5）R語言（version 3.4.1）；（6）軟件Cytoscape 3.8。

1.2 實驗細胞 RPMI-8226細胞株購于武漢普諾賽生命科技有限公司，于-180 ℃液氮環境下保存。

1.3 實驗動物 20只SPF級SD雄性大鼠，體質量為（200±20）g，購于長沙市天勤生物技術有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK（湘）2019-0014，飼養于廣西中醫藥大學SPF級實驗室，動物飼養環境溫度為（23±2）℃，相對濕度為（50±10）%，12 h光照/12 h黑暗循環，自由攝食飲水，飼料和飲用水均高壓消毒，所用大鼠實驗前均適應性飼養1周。經廣西中醫藥大學倫理委員會審核批準后開展實驗，批準編號：approval NO.DW20220511-079。

1.4 藥物與試劑 毒結清復方，方藥組成：人參10 g，黃芪20 g，補骨脂15 g，菟絲子15 g，白術30 g，薏苡仁15 g，當歸10 g，三七8 g，沉香1.5 g，川芎10 g，蟾皮5 g，土鱉蟲5 g，蘄蛇10 g，佛手8 g，解毒草20 g，土茯苓30 g，八角蓮20 g，白花蛇舌草20 g，八月札10 g，山慈菇10 g，蜈蚣半條。上述中藥飲片均購于廣西中醫藥大學第一附屬醫院，并經廣西中醫藥大學第一附屬醫院藥學部文雋主任藥師鑒定合格。胎牛血清（批號：12B052）購自ExCell Bio公司；青鏈霉素混合液（批號：P1400）購自Solarbio公司；CCK8試劑（批號：BS350B）購自Biosharp公司；兔抗人β連接蛋白（β-catenin）一抗（批號：00103090）、兔抗人Wnt1一抗（批號：00095183）、兔抗人周期蛋白D1（cyclinD1）一抗（批號：10016419）均購自Proteintech公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH-抗）（批號：22004515）、山羊抗GAPDH兔IgG HRP標記二抗（批號：22004515）均購自Biosharp公司。

1.5 主要儀器 Mini-protean tetra蛋白垂直電泳系統（美國Bio-Rad公司）；TY-201-01 M-Blot快速轉膜儀（南京中科通儀科技有限公司）；Multiskan FC酶標儀（賽默飛世爾科技公司）；AI 600多功能成像儀（美國GE公司）。

2 方 法

2.1 網絡藥理學預測

2.1.1 獲取毒結清復方中藥物的活性成分與靶標蛋白 將毒結清復方中的“人參”“黃芪”“補骨脂”“菟絲子”“白術”“薏苡 仁”“當 歸”“三 七”“沉 香”“川 芎”“蜈 蚣”“蟾 皮”“土 鱉 蟲”“蘄蛇”“佛手”“解毒草”“土茯苓”“八角蓮”“白花蛇舌草”“八月札”“山慈菇”輸入TCMSP中，設定口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18，篩選出該方每味中藥的有效成分及其對應的靶標蛋白。未收錄在TCMSP的中藥，利用本草組鑒數據庫搜索獲取中藥對應成分，再將成分輸入至TCMSP，根據成分對應的OB及DL值，篩選具有活性的中藥成分，并獲取該成分相應的靶標蛋白。利用Uniprot的Swiss-Prot子數據庫對上述獲得的靶標蛋白進行統一規范化注釋，獲取靶標蛋白對應的基因名稱。

2.1.2 篩選MM疾病靶點 以“Multiple Myeloma”為關鍵詞在GeneCards數據庫搜索，得到MM疾病靶點。

2.1.3 潛在治療靶點獲取與蛋白交互網絡構建及分析 在R語言環境下，將毒結清復方的靶標蛋白與MM疾病靶點基因取交集，得到交集靶點，即毒結清復方治療MM的潛在治療靶點，在線繪制韋恩圖將交集靶點可視化。將潛在治療靶點導入到String數據庫中，將最低交互要求分數設為0.9，構建交集靶點的蛋白交互網絡（PPI），使用Cytoscape插件Cytohubba插件對PPI網絡計算拓撲參數[最大團中心性（maximal clique centrality, MCC）、節點度值（degree centrality, DC）、接近中心度（closeness centrality, CC）、介數中心度（betweenness centrality, BC）]值，若交集靶點的以上4個參數值均大于各參數均值，即為核心靶點。

2.1.4 核心靶點的富集分析 利用R語言中的clusterProfiler包，對核心靶點進行GO及KEGG富集分析，設置P<0.05，并根據P值大小，對結果升序排序，將前20條目結果可視化。

2.2 體外細胞實驗2.2.1 細胞培養 人多發性骨髓瘤RPMI8226細胞培養于含有10%胎牛血清和1%青鏈霉素混合液的完全培養基中，置于37 ℃、5%CO2的恒溫箱中培養，2～3 d換液，當細胞密度達到3×105～2×106個/mL，以1∶3傳代。取處于對數生長期且生長狀態良好的細胞用于后續實驗。

通過南通地名變遷，考察南通社會的發展變遷，社會進步，從而產生對社會的認可、對社會制度的理解、對社會環境資源配置的厚重感。南通從條件惡劣轉變為不受氣候天災影響，從最偏僻唯恐避之不及的邊疆轉變為各方打工者懷揣夢想追逐之地，從只能從事圍土晾曬的制鹽業發展到農工商各行業發達；從少有文明種子播撒的蠻荒之地進化為尊師重教已經內化為傳統習俗的文明之所，通過歷史演變激發可以民眾愛家鄉愛國熱情。

2.2.2 血清制備 毒結清復方水煎劑的制備：將毒結清復方按照原方劑量稱取，加10倍量純水，浸泡30 min，煎煮30 min，過濾并收集原藥液。剩余藥渣中再加入8倍量純水，煎煮20 min，過濾并收集濾液，此過程重復2次。合并3次濾液，濃縮至生藥濃度為1.4 g/mL的毒結清復方水煎劑，4 ℃保存備用。

20只SD大鼠適應性飼養3 d，并隨機分為毒結清復方組、正常組，每組10只。毒結清復方組大鼠灌胃給予2 mL 1.4 g/mL毒結清復方水煎劑；正常組大鼠灌胃2 mL PBS，2次/d，連續7 d。末次灌胃后2 h，麻醉下于無菌環境下腹主動脈采血。全血于室溫靜置1 h，3 000 r/min離心15 min，取出上層血清，于56 ℃水浴30 min滅活，-80 ℃冰箱貯藏，備用。使用RPMI-1640培養液配置含有20%、10%、5%含藥血清的培養液，0.22 μm濾膜過濾除菌后使用。

2.2.3 CCK-8法檢測RPMI-8226細胞活力 取處于對數生長期的RPMI-8226細胞，細胞濃度調整為1×105個/mL，每孔100 μL細胞液接種于96孔板中，置于37 ℃、5% CO2的恒溫箱中適應性培養24 h后隨機分組，每組分別加入20%、10%、5%含藥血清，分別命名為高劑量組、中劑量組、低劑量組；設置對照組，加入10%空白血清。每組5個復孔。放置于37 ℃、5% CO2的恒溫箱培養，分別培養12、24、36 h后取出細胞，每孔中加入CCK-8試劑10 μL，避光，37 ℃、5%CO2培養箱孵育4 h后，通過酶標儀在450 nm處檢測細胞吸光度（OD）值。并通過公式計算細胞活力。細胞活力（%）=（A0-A1）/（A2-A3）×100%，其中A0代表含有細胞、含藥血清和CCK-8溶液孔的OD值；A1代表無細胞，含有含藥血清和CCK-8溶液孔的OD值；A2代表含有細胞、空白血清和CCK-8溶液孔的OD值；A3代表無細胞，含有空白血清和CCK-8溶液孔的OD值。

2.2.4 ELISA檢測Wnt1、β-catenin、cyclin D1蛋白含量 取處于對數生長期的RPMI-8226細胞，細胞濃度調整為1×105個/mL，每孔100 μL細胞液接種于96孔板中，為避免骨髓瘤細胞自分泌IL-6對細胞增殖的干擾，首先各組中加入IL-6 1.0 ng/mL單抗中和骨髓瘤分泌的IL-6，靜置中和4 h后隨機分組，每組分別加入20%、10%、5%含藥血清，分別命名為高劑量組、中劑量組、低劑量組，并設置對照組，加入10%空白血清。每組5個復孔。24 h后收集各組細胞上清液或細胞裂解液，使用ELISA試劑盒檢測Wnt1、β-catenin、cyclin D1蛋白含量。具體操作步驟按照說明書進行。

2.2.5 Western blotting檢測Wnt1、β-catenin、cyclin D1蛋白相對表達量 取處于對數生長期的RPMI-8226細胞，細胞濃度調整為3×105個/mL，每孔2 mL，細胞液接種于6孔板中，靜置中和4 h后隨機分組，每組分別加入20%、10%、5%含藥血清，分別命名為高劑量組、中劑量組、低劑量組，并設置對照組，采用ECL化學發光顯影劑于顯影儀中顯影。收集圖片，采用Image J軟件對圖片處理，計算各目標蛋白條帶的灰度值，后續進行統計學分析，計算Wnt1、β-catenin、cyclin D1蛋白相對表達量。

2.3 統計學方法 采用SPSS 23.0軟件進行統計分析，計量資料以“均數±標準差”（±s）表示，多樣本比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗，兩樣本比較采用成組t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結 果

3.1 網絡藥理學預測結果

圖1 毒結清復方有效成分與多發性骨髓瘤疾病靶點韋恩圖

3.1.2 PPI網絡及核心靶點 將藥物-疾病交集靶點導入String數據庫，以高可信度選項構建蛋白互作（PPI）網絡。（見圖2）利用多個拓撲參數比單用Degree參數更能客觀地反映節點的重要性，故本研究利用Cytoscape插件Cytohubba算PPI網絡拓撲參數，得到MCC、DC、CC、BC參數值。各參數值均數分別為7 003.02、9.74、62.42、298.67。以靶點拓撲參數大于均數為篩選規則，從PPI網絡中篩選得到13個核心靶點。（見表1）

圖2 蛋白互作網絡（PPI）

表1 PPI 網絡核心靶點

3.1.3 交集靶點富集分析 在R語言環境下利用clusterProfiler包，導入148個交集靶點進行富集分析，得到KEGG富集結果155條，根據校正P值及Count數，以氣泡圖形式可視化前20條。（見圖3）其中包括低氧誘導因子1信號通路（HIF-1 signaling pathway）、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥性（EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance）、IL-17信號通路（IL-17 signaling pathway）、PI3K-Akt信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）、細胞衰老（Cellular senescence）等與MM疾病進展與治療效果密切相關的通路。結合Pubmed、Google Scholar檢索查閱文獻發現，除了可視化的20條通路外，其余135條結果中包含有Ras信號通路（Ras signaling pathway）、NF-κB信號通路（NF-κB signaling pathway）、JAK-STAT信號通路（JAK-STAT signaling pathway）、mTOR信號通路（mTOR signaling pathway）、Wnt信號通路（Wnt signaling pathway）等與MM疾病密切相關的通路，表明毒結清復方可能通過多條通路起到治療MM的作用。在基礎實驗過程中發現，Wnt信號通路在參與骨髓瘤的增殖和骨破壞中起非常重要的作用[9-10]。目前研究中發現該通路的作用機制和效應遠比可視化圖排位重要得多，故認為毒結清復方可能通過Wnt信號通路起到治療MM的作用，后續實驗研究也圍繞Wnt信號通路開展實驗驗證。

圖3 交集靶點KEGG 富集分析

GO富集分析得到生物過程1 682條，分子功能98條，細胞成分36條，分別以氣泡圖可視化前20條。（見圖4）生物過程主要包括內毒素應答（response to lipopolysaccharide）、對細菌源分子的應答（response to molecule of bacterial origin）、對營養水平的應答（response to nutrient levels）、對氧水平的應答反應（response to oxygen levels）、氧化應激反應（response to oxidative stress）、對抗生素的應答反應（response to antibiotic）、缺氧應激反應（response to hypoxia）、對低氧水平的應答（response to decreased oxygen levels）等條目，這些條目主要與體內氧水平及細菌感染相關。分子功能主要包括DNA結合轉錄因子結合（DNA-binding transcription factor binding）、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性（protein serine/threonine kinase activity）、信號分子（receptor ligand activity）、信號受體激活物的活性（signaling receptor activator activity）、RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結合轉錄因子結合（RNA polymerase Ⅱ-specific DNA-binding transcription factor binding）等。細胞成分主要包括細胞膜（membrane region）、染色質（nuclear chromatin）、轉錄因子復合體（transcription regulator complex）等。

圖4 交集靶點GO 富集分析

3.1.4 構建“中藥-有效成分-靶點-通路”網絡 利用上述過程得到的中藥及中藥有效成分、交集靶點和KEGG富集分析結果構建“中藥-有效成分-靶點-通路”網絡。（見圖5）

圖5“中藥-有效成分-靶點-通路”網絡圖

3.2 體外實驗研究

3.2.1 毒結清復方對RPMI-8226細胞活力的影響 與對照組比較，低、中、高劑量組RPMI-8226細胞12、24、36 h的OD值均明顯降低（P<0.05），且存在劑量依賴性，即高劑量組RPMI-8226細胞12、24、36 h的OD值均低于中劑量組（P<0.05），中劑量組RPMI-8226細胞12、24、36 h的OD值均低于低劑量組（P<0.05）。（見圖6）

圖6 各組RPMI-8226 細胞OD 值比較 （±s，n=5）

3.2.2 各組RPMI-8226細胞Wnt1、β-catenin、cyclin D1蛋白含量比較 與對照組比較，低、中、高劑量組RPMI-8226細胞Wnt1、β-catenin、cyclin D1蛋白含量均明顯降低（P<0.05），且呈劑量依賴性；高劑量組RPMI-8226細胞Wnt1、β-catenin、cyclin D1蛋白含量均明顯低于中劑量組（P<0.05）；中劑量組RPMI-8226細胞β-catenin、cyclin D1蛋白含量均明顯低于低劑量組（P<0.05），Wnt1蛋白含量與低劑量組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。（見表2）

表2 各組RPMI-8226 細胞Wnt1、β-catenin、cyclin D1蛋白含量比較 （±s，pg/mL）

表2 各組RPMI-8226 細胞Wnt1、β-catenin、cyclin D1蛋白含量比較 （±s，pg/mL）

注：與對照組比較，aP<0.05；與低劑量組比較，bP<0.05；與中劑量組比較，cP<0.05

組別 n Wnt1 β-catenin cyclin-D1對照組 5 213.80±7.82 859.12±29.27 315.67±11.58低劑量組 5 124.77±1.96a 687.28±29.62a 288.42±9.81a中劑量組 5 122.40±7.28a 615.88±26.38a b 240.47±0.63a b高劑量組 5 111.82±7.75a bc 552.61±29.00a bc 188.45±0.90a bc F 252.415 106.922 165.364 P 0.000 0.000 0.000

3.2.3 各組RPMI-8226細胞Wnt1、β-catenin、cyclin D1蛋白相對量比較 與對照組比較，低、中、高劑量組RPMI-8226細胞β-catenin蛋白相對表達量均明顯降低（P<0.05），且高劑量組RPMI-8226細胞β-catenin蛋白相對表達量明顯低于低劑量組（P<0.05）。與對照組比較，中、高劑量組RPMI-8226細胞Wnt1、cyclin D1蛋白相對表達量均明顯降低（P<0.05），高劑量組RPMI-8226細胞Wnt1、cyclin D1蛋白相對表達量均明顯低于低劑量組（P<0.05）；高劑量組RPMI-8226細胞Wnt1蛋白相對表達量明顯低于中劑量組（P<0.05）。（見圖7、表3）

圖7 各組RPMI-8226 細胞Wnt1、β-catenin、cyclin D1 蛋白表達Western blotting 圖

表3 各組RPMI-8226 細胞Wnt1、β-catenin、cyclin D1 蛋白相對表達量比較 （±s）

表3 各組RPMI-8226 細胞Wnt1、β-catenin、cyclin D1 蛋白相對表達量比較 （±s）

注：與對照組比較，aP<0.05；與低劑量組比較，bP<0.05；與中劑量組比較，cP<0.05

組別 n β-catenin Wnt1 cyclinD1對照組 3 1.00±0.09 1.00±0.11 1.00±0.02低劑量組 3 0.62±0.13a 0.94±0.07 0.94±0.06中劑量組 3 0.49±0.04a 0.69±0.09a b 0.78±0.05a高劑量組 3 0.39±0.04a b 0 .48±0.12a b c 0.71±0.09a b F 29.061 17.576 141.100 P 0.000 0.001 0.001

4 討 論

中醫學根據MM臨床癥狀，將其歸屬于“骨痹”“骨蝕”“虛勞”的范疇，認為本病乃本虛標實之證，以肝、脾、腎三臟虧損為本，痰、濕、毒蘊、血瘀為標[9]。近代許多醫家應用中藥、中成藥治療MM及相關外周神經并發癥取得了良好的療效[10-12]。中醫血液學專家應用補腎通絡、祛瘀消瘤法治療骨髓瘤髓外病變取得明顯療效，對于髓外病變，施以馬錢子、黃鼠骨粉聯合中藥內服可達到縮小局部軟組織腫瘤的效果[13-15]。

本研究通過網絡藥理學方法，利用KEGG富集分析發現毒結清復方對MM的治療作用可能是通過調控Wnt1、NF-κB、PI3K/AKT、AP-1和MAPK等多通路起到治療MM疾病的作用[16-17]。Wnt通路及其下游sclerostin蛋白在骨髓瘤腫瘤增殖和骨破壞發揮重要作用，因此，本研究重點探討該通路及其相關蛋白表達。

Cyclin D1蛋白是Wnt信號通路下游的轉錄蛋白。Wnt信號通路是高度保守的信號轉導通路，在正常情況下，其不存在Wnt配體，β-catenin主要被糖原合成酶激酶3（GSK3）和酪蛋白激酶1α（CK1α）磷酸化，并被E3泛素蛋白連接酶泛素化后降解。當Wnt/β-bcatenin信號通路異常激活時，大量的Wnt蛋白與其受體結合，抑制GSK-3b活性及β-catenin降解，導致β-catenin在細胞質中的積累。當β-catenin濃度達到一定水平時，其可轉移至細胞核中，調節Wnt靶基因如癌基因Myc、Cyclin D1的表達[18]。Wnt/β-catenin信號通路及下游CCND1轉錄蛋白通過調節MM細胞的分化、增殖、凋亡和遷移參與MM的發病機制。GUO B L等[19]研究發現在MM患者體內過表達miR-744-5p可以靶向癌癥相關蛋白SOX12而抑制Wnt/βcatenin信號通路，進而抑制MM細胞增殖、侵襲、遷移。多個臨床前MM模型研究發現，阻斷Wnt信號抑制劑（DKK1、SFRP-2、sclerostin）可增加成骨細胞的形成，減少溶骨性病變[17,20-21]。Wnt信號通路一方面參與MM細胞的增殖、遷移，另一方面在骨生長、發育過程中發揮著重要的作用[22-23]。本研究發現cyclinD1只有在高劑量干預下才與對照組有差異，這表明要克服增殖旺盛的細胞需要高劑量毒結清復方干預才能實現。

本研究結果表明，毒結清復方可降低RPMI-8226細胞活力，抑制其增殖，并且抑制作用和時間呈濃度依賴，同時發現毒結清含藥血清可以抑制骨髓瘤細胞株RPMI-8226細胞wnt/β-bcatenin信號通路中Wnt1、β-catenin、cyclin D1蛋白濃度。因此推測在Wnt經典信號通路中，毒結清是通過降低β-catenin蛋白濃度，從而減少轉移入細胞核中的β-catenin數量，使β-catenin的數量減少從而導致cyclin D1蛋白轉錄減少。cyclin D1轉錄減少就會導致腫瘤細胞更多停留在G0期，腫瘤細胞繁殖減慢，從而達到減少腫瘤負荷的目的。毒結清復方中槲皮素為主要抗骨髓瘤成分，類似柚皮素抗骨髓瘤增殖的實驗在多通路中也有驗證。徐亞文等[24]研究發現槲皮素在骨髓瘤細胞株中通過誘導細胞凋亡、促進細胞周期阻滯而發揮抗腫瘤作用。楊軍嶺等[25]研究發現槲皮素能夠通過抑制NF-κB信號通路而降低骨髓瘤細胞的侵襲和遷移能力。據此本研究推測：毒結清復方通過多靶點、多通路對骨髓瘤細胞增殖發揮抑制作用，從而達到治療目的。

IL-6可促進MM細胞生長，引起機體免疫紊亂及病理損傷，使機體腫瘤負荷持續增加，貧血和骨病持續加重。骨硬化蛋白（sclerostin）是一種來源于骨細胞的分泌蛋白，它可以通過抑制Wnt/β-catenin通路來抑制骨的形成，同時受到多種細胞因子及mRNA等多因素調控。β2-微球蛋白（β2-MG）與MM細胞的克隆及增殖活性相關，能直接反映患者體內的腫瘤負荷。毒結清復方聯合化療可降低MM患者體內血鈣、sclerostin、白細胞介素-6（IL-6）、C反應蛋白（CRP）及β2-MG水平，從而有效緩解MM患者骨痛癥狀，抑制腫瘤進展[6,26-27]。本研究推測毒結清在對MM細胞的抑制作用過程中是多方面、多通路的抑制作用，而Wnt1/β-catenin是一條重要的通路。

綜上所述，本研究基于網絡藥理學對毒結清復方與MM疾病靶點間復雜的網狀關系進行研究，預測藥物主要活性成分、作用靶點及相關通路，最后通過體外細胞實驗初步驗證網絡藥理學的預測。下一步我們將通過提取患者體內腫瘤細胞對毒結清復方治療MM的作用進行進一步確證，以期得到治療骨髓瘤有效的機制探討。