基于Q-Orbitrap MS/MS的山銀花標準湯劑多指標成分定量及指紋圖譜研究*

孫冬梅，丁 青，劉曉霞，陶晨璐，劉艷梅，李振雨，朱德全，陳向東

（廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業重點實驗室，廣東 佛山 528244）

中藥飲片標準湯劑是以中醫理論為指導、臨床應用為基礎，參考現代提取方法，經標準化工藝制備而成的單味中藥飲片水煎劑。中藥飲片標準湯劑可用于標化臨床用藥，保障用藥的準確性和劑量的一致性，規范目前臨床廣泛使用的包括配方顆粒在內的新型飲片形式[1]。

山銀花，主產于湖南南部及西部、廣西東北部、貴州東部和西北部[2]，為忍冬科植物灰氈毛忍冬Lonicera macranthoidesHand.-Mazz.、紅腺忍冬Lonicera hypoglaucaMiq.、華南忍冬Lonicera confusaDC.或黃褐毛忍冬Lonicera fulvotomentosaHsu et S.C.Cheng的干燥花蕾或帶初開的花[3]。山銀花味甘，性寒，歸肝、心、肺經，有清熱解毒、疏風散熱之功。其主要用于治療癰腫疔瘡、喉痹、丹毒、熱毒血痢、風熱感冒、溫病發熱。目前，從山銀花中已分離鑒定出200多種化合物，主要包括有機酸類、黃酮類、三萜皂苷類、生物堿類、環烯醚萜類等[4]。山銀花中的酚酸類成分對多種致病菌和病毒具有較強的抑制和殺滅作用，皂苷類成分具有保肝作用[5]。山銀花的相關文獻報道多集中于藥材、飲片等原料的質量研究[6-8]，而關于山銀花標準湯劑質量研究內容頗少。本研究收集了15批來自廣西壯族自治區桂林市、湖南省邵陽市、湖南省懷化市、貴州省遵義市的山銀花藥材，并按照標準湯劑制備方法制備成山銀花標準湯劑，建立了山銀花標準湯劑指紋圖譜結合多成分定量測定的檢測方法，以及對共有指紋峰采用Q-Orbitrap MS/MS技術進行鑒定，對山銀花標準湯劑進行全面的質量評價，旨在為以標準湯劑為基礎的其他山銀花制劑質量評價提供參考依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器 VanquishTM超高效液相色譜儀（賽默飛世爾科技有限公司）；Q-Exactive-Orbitrap型Thermo Vanquish Flex超高效液相-Thermo Fisher 高分辨質譜聯用儀，配備光電二級管陣列檢測器（DAD）（賽默飛世爾科技有限公司）；Waters ACQUITY HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；ME204E型萬分之一天平（METTLER TOLEDO公司）；XP26型百萬分之一天平（METTLER TOLEDO 公司）；HWS-28型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司）；KQ-500DE型超聲清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑 綠原酸對照品（批號：110753-201817，含量：96.80%）、灰氈毛忍冬皂苷乙對照品（批號：111814-201604，含量：94.40%）、川續斷皂苷乙對照品（批號：111813-201804，含量：96.80%）均購于中國食品藥品檢定研究院；新綠原酸（批號：wkq18030107，含量：98.0%）、異綠原酸A（批號：wkq18041207，含量：98.0%）、異綠原酸C（批號：wkq18050905，含量：98.0%）、異綠原酸B（批號：wkq21022206，含量：98.0%）均購于四川維克奇生物技術有限公司；乙腈為色譜純，購自默克股份有限公司；甲酸為色譜純，購自上海安譜實驗科技股份有限公司；甲醇為分析純，購自西隴科學股份有限公司；磷酸為色譜純，購自天津市科密歐化學試劑有限公司；Milli-Q超純水實驗室自制。

1.3 材料 試驗用15批山銀花于2020年6—7月采摘，采摘后的藥材以蒸汽殺青，置50～55 ℃電熱恒溫鼓風干燥箱中烘干，即得。樣品依次編號為S1～S15，樣品信息見表1，經廣東一方制藥有限公司魏梅主任中藥師鑒定，為忍冬科植物灰氈毛忍冬Lonicera macranthoidesHand.-Mazz.。15批樣品按照2020年版《中華人民共和國藥典》山銀花項下規定進行檢驗，符合規定。

表1 山銀花樣品信息

2 方法與結果

2.1 山銀花標準湯劑的制備 取山銀花飲片100 g，置電熱陶瓷壺中，加水煎煮2次，第1次煎煮加12倍量水，浸泡30 min，武火（500 W）加熱煮沸后文火（200 W）保持微沸30 min，用350目篩趁熱過濾，濾液迅速用冷水冷卻；第2次煎煮加10倍量水，武火（500 W）加熱煮沸后文火（200 W）保持微沸25 min，用350目篩趁熱過濾，濾液迅速用冷水冷卻；合并2次濾液，減壓濃縮至清膏體積約為150 mL，分裝至10 mL西林瓶中，每瓶分裝2 mL，真空冷凍干燥，取出，軋鋁蓋，即得。

2.2 指紋圖譜方法

2.2.1 對照品溶液的制備 取綠原酸對照品2.801 mg、新綠原酸對照品2.297 mg、異綠原酸A對照品2.328 mg、異綠原酸C對照品2.130 mg、灰氈毛忍冬皂苷乙對照品2.067 mg、川續斷皂苷乙對照品2.146 mg、異綠原酸B對照品2.129 mg，置于5 mL容量瓶中，加甲醇溶解制成質量濃度分別為542.274、450.212、456.288、417.480、390.250、415.466、417.284 μg/mL 的混合對照品溶液a。取隱綠原酸對照品2.122 mg，置于5 mL溶量瓶中，加甲醇溶解制成質量濃度415.912 μg/mL的對照品溶液b。

2.2.2 供試品溶液的制備 取山銀花標準湯劑凍干粉約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，密塞，稱定質量，超聲處理30 min，放冷，再稱定質量，用70%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.2.3 色譜條件 色譜柱：Waters ACQUITY HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），流動相為乙腈（A）-0.05%磷酸溶液（B），梯度洗脫，0～1 min，7%A～10%A，1～9 min，10%A～21%A，9～24 min，21%A～42%A；流速：0.3 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：1 μL；檢測波長：210 nm。

2.3 指紋圖譜方法學驗證

2.3.1 精密度試驗 取山銀花標準湯劑S1供試品溶液，按“2.2.3”項下色譜條件進樣，連續進樣測定6次，以16號峰（異綠原酸A）為參照峰，計算21個指紋峰的相對保留時間RSD值在0.03%～0.24%范圍內，相對峰面積RSD值在0.26%～0.86%范圍內，表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩定性試驗 取山銀花標準湯劑S1供試品溶液，于室溫下放置，分別在制備后的2、5、8、13、16 h，按“2.2.3”項下色譜條件進樣測定，以16號峰（異綠原酸A）為參照峰，計算21個指紋峰的相對保留時間RSD值在0.17%～0.89%范圍內，相對峰面積RSD值在1.05%～2.13%范圍內，表明供試品溶液在16 h內穩定。

2.3.3 重復性試驗 取同一批山銀花標準湯劑6份，按“2.2.2”項下制備6份供試品溶液，按“2.2.3”項下色譜條件進樣測定，以16號峰（異綠原酸A）為參照峰，計算21個指紋峰的相對保留時間RSD值在0.14%～0.49%范圍內，相對峰面積RSD值在0.97%～2.43%范圍內，表明該方法重復性良好。

2.4 指紋圖譜測定與分析 取15批不同產地的山銀花標準湯劑，按“2.2.2”項下制備供試品溶液，按“2.2.3”項下色譜條件進樣測定，記錄15批山銀花標準湯劑色譜圖，并將所有的色譜圖導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》2012版進行分析。以S1為參照圖譜，對15批山銀花標準湯劑指紋圖譜共有峰進行匹配，選擇分離度較好，峰型對稱，峰純度高的色譜峰為指紋峰，共標定21個指紋峰，共有峰模式見圖1，山銀花標準湯劑S1和對照品色譜圖見圖2。采用平均數法生成對照指紋圖譜，進行相似度計算，15批不同產地的山銀花標準湯劑樣品相似度在0.90以上，表明不同產地的山銀花標準湯劑相似度較高。由于16號峰峰面積較大，成分已知，出峰位置居中，因此選擇16號峰（異綠原酸A）為參照峰，計算15批山銀花標準湯劑共有峰的相對保留時間RSD值在0.04%～0.64%范圍內，相對峰面積RSD值在18.80%～123.73%范圍內。

圖1 15 批山銀花標準湯劑指紋圖譜疊加圖及對照指紋圖譜

圖2 HPLC 色譜圖

2.4.1 聚類分析 采用SPSS 20.0軟件，對15批山銀花標準湯劑指紋圖譜共有峰峰面積進行標準化處理，采用Ward法，以平方歐氏距離為測度，全矩從0到1標準化轉化，進行聚類分析，結果見圖3。當分類間距離在15時，山銀花標準湯劑被分為4類，其中S1、S4～S12、S14～S15聚為一類，S2、S3、S13各自聚為一類；而S2、S3、S13都來自于廣西壯族自治區桂林市；分類結果表明當前方法不可區分不同產地的山銀花標準湯劑，相同產地或不同產地的山銀花標準湯劑既具有相似性又具有差異性。

圖3 15 批山銀花標準湯劑聚類分析樹狀圖

2.4.2 主成分分析 采用SPSS 20.0軟件，將15批山銀花標準湯劑指紋圖譜共有峰峰面積進行標準化處理，計算主成分特征值、累積貢獻率及主成分得分。以特征值大于1為標準，提取出的主成分有5個，累積方差貢獻率為87.340%，表明提取出的5個主成分反映了15批山銀花標準湯劑指紋圖譜的主要信息，碎石圖進一步說明了5個主成分可以表征山銀花標準湯劑的整體特征。（見圖4）根據載荷矩陣分析結果，可知，主成分1與10個指紋峰有關，主成分2與11個指紋峰有關，主成分3與10個指紋峰有關，主成分4與16個指紋峰有關，主成分5與12個指紋峰有關，表明山銀花的質量差異是由多個成分共同作用引起。（見表2）

表2 15 批山銀花標準湯劑載荷矩陣圖

圖4 15 批山銀花標準湯劑主成分分析碎石圖

2.4.3 正交偏最小二乘法判別分析 為了進一步研究不同批次間山銀花標準湯劑的質量差異，將15批山銀花標準湯劑指紋圖譜共有峰峰面積同時導入SIMCA14.1軟件，采用正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA），以21個指紋峰峰面積為變量建立OPLS-DA。根據結果可知，R2x為0.993，R2y為0.826，Q2為0.787，表明模型可靠，預測程度較好。根據變量權重VIP值篩選引起不同批次之間質量差異的特征性成分，選取VIP值＞1的變量指標為質量標志物。結果表明，在21個指紋峰中峰3、峰5（新綠原酸）、峰6、峰7、峰11（隱綠原酸）、峰12、峰15（異綠原酸B）、峰16（異綠原酸A）、峰18（異綠原酸C）、峰21（川續斷皂苷乙）的VIP值均大于1。（見圖5）這些成分是15批山銀花標準湯劑之間產生差異的主要原因，為了更加全面、有效評價山銀花標準湯劑質量，應重點關注上述成分的質量變化。

圖5 15 批山銀花標準湯劑各成分VIP 值圖

圖6 山銀花標準湯劑負離子模式（A）和正離子模式（B）下一級離子流圖

2.5 共有峰的鑒定

2.5.1 色譜條件 色譜柱：Waters ACQUITY HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），流動相為乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B），梯度洗脫，0～1 min，7%A～10%A，1～9 min，10%A～21%A，9～24 min，21%A～42%A；24～48 min，42%A～100%A；流速：0.3 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：1 μL；檢測波長：210 nm。

2.5.2 質譜條件 采用電噴霧離子源（ESI），噴霧電壓為3.2 kV(+/-)，S-lens電壓為50 V；鞘氣流速為35 arb；輔助氣流速為10 arb；毛細管溫度為350 ℃；質荷比范圍為100～1 500；數據采集模式：正負離子同時掃描（Full ms dd-MS2 Discovery）；分辨率為17 500，碰撞能（NCE）為20 V。

取“2.2.2”項下制備供試品溶液，按照“2.5”項下的色譜與質譜條件進行分析，得到山銀花標準湯劑正、負離子模式下的一級離子流及二級離子流圖。（見圖3）根據實際測得的相對分子質量與理論相對分子質量二者偏差小于5 ppm，同位素豐度比及一級、二級質譜碎片信息以及文獻報道等，結合Xcalibur數據處理平臺、Thermo m/z Vault數據庫，對21個共有指紋峰進行化合物推斷鑒別，鑒定結果見表3。其中8種成分采用對照品對比確認，分別為峰5（新綠原酸）、峰9（綠原酸）、峰11（隱綠原酸）、峰15（異綠原酸B）、峰16（異綠原酸A）、峰18（異綠原酸C）、峰19（灰氈毛忍冬皂苷乙）、峰21（川續斷皂苷乙）；其余13個成分根據產生的二級質譜碎片離子與文獻報道進行比對推導；例如保留時間為1.20 min的峰1，正離子掃描模式下準分子離子峰為（m/z）268.103 7，二級裂解碎片可見（m/z）136.061 6、（m/z）137.066 0，通過Xcalibur數據處理平臺、Thermo m/z Vault數據庫鑒定該化合物為腺苷；保留時間為3.68 min的峰5，負離子掃描模式下準分子離子峰為（m/z）353.087 7，二級裂解碎片可見（m/z）179.034 1、（m/z）191.055 4、（m/z）192.058 7，通過Xcalibur數據處理平臺、Thermo m/z Vault數據庫以及對照品比對確定該化合物為新綠原酸；保留時間為4.93 min的峰8，負離子掃描模式下準分子離子峰為（m/z）389.108 8，二級裂解碎片可見（m/z）345.119 3、（m/z）209.048 8，通過Xcalibur數據處理平臺以及文獻報道鑒定該化合物為斷馬錢子苷半縮醛內酯。

表3 山銀花標準湯劑共有指紋峰化學成分鑒定結果

2.6 多成分含量測定 山銀花標準湯劑指紋圖譜化學劑量分析結果表明峰3、峰5（新綠原酸）、峰6、峰7、峰11（隱綠原酸）、峰12、峰15（異綠原酸B）、峰16（異綠原酸A）、峰18（異綠原酸C）、峰21（川續斷皂苷乙）為質量標志物，而峰9（綠原酸）、峰19（灰氈毛忍冬皂苷乙）既為共有峰，且成分已知，因此本試驗在指紋圖譜的基礎上，對上述已采用對照品確定的8種成分進行含量測定。

2.6.1 線性關系考察 精密吸取混合對照品溶液a 1 mL，分別置于2、5、10、20 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，進樣分析。精密吸取對照品溶液b 1 mL，分別置于2、5、10、20 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，進樣分析。記錄8種成分的峰面積，以進樣的質量濃度為橫坐標（x），以峰面積為縱坐標（y），繪制標準曲線，線性結果見表4。

表4 8 種成分的保留時間、線性回歸方程、相關系數、線性范圍、檢測限和定量限

2.6.2 精密度試驗 取“2.2.1”項下對照品溶液，按“2.2.3”項下色譜條件進樣，連續進樣測定6次，記錄8種成分的峰面積，計算RSD值。結果顯示新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、灰氈毛忍冬皂苷乙、川續斷皂苷乙的峰面積RSD值在0.23%～0.96%范圍內，表明儀器的精密度良好。

2.6.3 穩定性試驗 取山銀花標準湯劑凍干粉（S1）供試品溶液，分別在制備后的0、2、8、12、16、24 h進樣測定，記錄8種成分的峰面積，計算峰面積的RSD值，結果顯示在24 h內新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、灰氈毛忍冬皂苷乙、川續斷皂苷乙的峰面積RSD值在0.23%～0.99%范圍內，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.6.4 重復性試驗 取同一批山銀花標準湯劑凍干粉（S1）樣品，按“2.2.2”項下供試品制備方法平行制備6份供試品溶液，按“2.2.3”項下色譜條件進樣測定。記錄8種成分的峰面積，并計算含量的RSD值。結果表明8種成分含量的RSD值在0.23%～2.13%范圍內，表明本試驗方法重復性良好。

2.6.5 加樣回收率試驗 取已知含量的山銀花標準湯劑凍干粉（S1）樣品，按對照品加入量與供試品中待測成分含量之比分別為0.5∶1、1∶1、1.5∶1設計3組，每組平行3份，分別加入8種待測成分對照品適量，按“2.2.2”項下制備6份供試品溶液，按“2.2.3”項下色譜條件進樣測定，記錄8種成分的峰面積，計算各成分含量及加樣回收率。結果顯示新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、灰氈毛忍冬皂苷乙、川續斷皂苷乙的平均加樣回收率分別為100.45%、96.38%、98.47%、103.11%、100.27%、98.59%、99.13%、99.46%，表明該方法的準確性良好

2.6.6 樣品測定 對15批山銀花標準湯劑凍干粉中的8種成分進行含量測定，結果見表5。

表5 15 批山銀花標準湯劑中8 種成分含量測定結果（mg/g）

3 討論

3.1 檢測波長的選擇 由于山銀花中有機酸類、黃酮類和環烯醚萜類成分較多，因此山銀花指紋圖譜檢測波長多集中在230～240 nm[11-12]或330～360 nm[13]。本試驗采用二極管陣列檢測器對山銀花標準湯劑指紋圖譜進行全波長掃描，發現在210 nm下指紋峰數量最多，峰容量更大；由于山銀花中的專屬性成分灰氈毛忍冬皂苷乙和川續斷皂苷乙共軛系統少，在其他檢測波長下無法檢出，因此在指紋圖譜和含量測定中以210 nm為檢測波長以全面表征山銀花標準湯劑的物質信息。

3.2 指紋圖譜分析 本研究采用了聚類分析、主成分分析、正交偏最小二乘法判別分析3種模式識別方法，篩選到10種差異性質量標志物，分別為峰3、峰5（新綠原酸）、峰6、峰7、峰11（隱綠原酸）、峰12、峰15（異綠原酸B）、峰16（異綠原酸A）、峰18（異綠原酸C）、峰21（川續斷皂苷乙）。朱香梅等[14]通過對山銀花種植資源、化學成分進行成分歸納總結后，預測山銀花中的質量標志物為綠原酸、咖啡酸、異綠原酸A、灰氈毛忍冬皂苷乙、川續斷皂苷乙、木犀草苷等，部分預測指標與本研究結果相同。后續研究應重點關注這10種成分的變化，并對未定量成分建立定量分析方法，以便科學評價山銀花標準湯劑的質量。

本研究發現，15批山銀花標準湯劑指紋圖譜的相對峰面積RSD值在18.80%～123.73%范圍內，表明不同批次的山銀花標準湯劑中指紋峰對應的化學成分組成比例差異較大，尤其峰2的相對峰面積RSD值最大，可能是由于該色譜峰峰面積較小，易受周圍雜質峰的影響，從而導致不同批次間峰面積積分差異較大。

3.3 Q-Orbitrap MS/MS分析 本試驗采用Q-Orbitrap MS/MS技術對山銀花標準湯劑中的共有指紋峰對應的化學成分進行鑒定。由于山銀花標準湯劑中的化合物主要為酚酸類，具有較多的羥基，可形成穩定的氧負離子，因此多數化合物在負離子模式下色譜峰的響應更好。21個共有指紋峰鑒定了18種化合物，有8種化合物已采用對照品進行確認，但是還有峰4、峰7、峰13在現有文獻和數據庫中尚未匹配到相對應的化合物，有待進一步研究。根據文獻報道，山銀花藥材中還含有黃酮類成分，如紫云英苷[15]、木犀草素-7-O-β-D-半乳糖苷[16]、山奈酚-3-O-蕓香糖苷[17]、木犀草素[18]等；環烯醚萜類成分，如開聯番木鱉苷[19]、裂環馬錢酸等；皂苷類成分，如α-常春藤皂苷元[20]、灰氈毛忍冬皂苷丙[20]、灰氈毛忍冬皂苷甲[21]等。上述成分在山銀花標準湯劑中尚未檢測到，可能是由于此類成分在山銀花藥材中含量和極性較低，在標準湯劑中轉移率低，因此標準湯劑中基本無響應。

3.4 含量測定分析 本研究基于山銀花標準湯劑指紋圖譜，對其中6種質量標志物及2種采用對照品確認的共有成分進行定量測定。8個含量測定指標中包括酚酸類成分6個，皂苷類成分2個。研究結果顯示不同批次的山銀花標準湯劑中各成分含量差異較大，尤其是酚酸類成分。文獻報道花蕾型灰氈毛忍冬黃白期灰氈毛忍冬皂苷乙顯著降低[22]，三青期的綠原酸含量最高，其次為大白、二白期，銀花、金花期綠原酸含量最低[23]，不同產地的山銀花花蕾中綠原酸、灰氈毛忍冬皂苷乙、川續斷皂苷乙的含量也存在較大差異[24]，因此不同批次的山銀花標準湯劑中各成分含量可能與地域因素、采收時間等有關。此外，根據文獻報道[25]，山銀花藥材中灰氈毛忍冬皂苷的含量最高，其次為綠原酸和異綠原酸A。而本研究結果也顯示山銀花標準湯劑中灰氈毛忍冬皂苷的含量最高，為（155.99±22.57）mg/g；其次為綠原酸（88.51±11.77）mg/g和異綠原酸A（35.99±12.69）mg/g，與文獻報道結果一致，表明這些極性較大的成分從藥材到標準湯劑轉移率良好，可以用于標化、表征水提物的一致性。