伴肝轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者微衛(wèi)星不穩(wěn)定率與PD-L1/PD-1表達(dá)及預(yù)后的相關(guān)性研究*

江少鋒,楊曉琳,賀 瀅

湖南省腫瘤醫(yī)院/中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院:1.消化泌尿內(nèi)一科;2.教學(xué)辦,湖南長沙 410006

微衛(wèi)星指基因組中一段具有高度突變性的簡(jiǎn)單重復(fù)序列,在DNA復(fù)制過程中微衛(wèi)星序列發(fā)生增減突變即為微衛(wèi)星不穩(wěn)定(MSI)。根據(jù)MSI突變位點(diǎn)數(shù)量的多少可劃分為高頻MSI(MSI-H)、低頻MSI(MSI-L)及微衛(wèi)星穩(wěn)定(MSS)。國內(nèi)最新的結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移診治指南[1-2]均推薦結(jié)直腸癌患者進(jìn)行MSI檢測(cè),進(jìn)而為精準(zhǔn)制訂治療策略提供依據(jù)。結(jié)直腸癌MSI-H的特點(diǎn)是早期MSI-H發(fā)生率約20%,晚期MSI-H發(fā)生率(約5%)遠(yuǎn)低于早期[3]。早期結(jié)直腸癌相關(guān)的研究認(rèn)為,MSI-H表明患者預(yù)后良好[4],且MSI狀態(tài)與程序性死亡配體1(PD-L1)/程序性死亡受體-1(PD-1)的表達(dá)具有相關(guān)性[5];而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的晚期結(jié)直腸癌中MSI-H的臨床意義尚存爭(zhēng)議,其與PD-L1表達(dá)的關(guān)系也不清楚。本研究將在發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者中分析MSI狀態(tài)與PD-L1表達(dá)、化療療效的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年1月至2020年3月在本院診斷為結(jié)直腸癌的472例患者作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)經(jīng)活組織病理檢查診斷為結(jié)直腸癌;(2)伴肝轉(zhuǎn)移和無轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸腫瘤;(3)有完整的臨床病理資料;(4)有完善的影像學(xué)資料可供評(píng)價(jià)腫瘤分期及療效。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)接受過放化療或靶向治療;(2)既往有其他惡性腫瘤病史;(3)合并除肝臟以外其他部位轉(zhuǎn)移。納入的472例結(jié)直腸癌患者中,伴肝轉(zhuǎn)移194例,無轉(zhuǎn)移278例。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),并取得所有患者的書面知情同意。

1.2方法

1.2.1MSI狀態(tài)的檢測(cè)及分組 取伴肝轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者及無轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者的原發(fā)灶,根據(jù)指南[1-2]推薦,采用免疫組化的方法檢測(cè)MSI。取病灶組織蠟塊,制作石蠟切片,對(duì)MutL蛋白同系物1(hMLH1)、MutS蛋白同系物2(hMLH2)、MutS蛋白同系物6(hMLH6)進(jìn)行免疫組化染色。由2名高年資病理科醫(yī)生在雙盲條件下進(jìn)行讀片,在400倍鏡下隨機(jī)觀察5個(gè)視野,細(xì)胞核呈棕色或棕黑色顆粒為陽性,陽性細(xì)胞占比<30%為陰性、≥30%為陽性。hMLH1、hMSH2、hMSH6 3個(gè)蛋白中2個(gè)及以上表達(dá)陰性判斷為MSI-H,1個(gè)表達(dá)陰性為MSI-L,3個(gè)均表達(dá)陽性為MSS。根據(jù)伴肝轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者M(jìn)SI狀態(tài)分為MSI-H組、MSI-L組、MSS組。

1.2.2PD-L1、PD-1 mRNA表達(dá)水平檢測(cè) 取伴肝轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者的原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶,采用總RNA提取試劑盒提取組織中的總RNA;采用cDNA第一鏈合成試劑盒對(duì)總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄、合成cDNA,采用熒光定量檢測(cè)試劑盒對(duì)PD-L1、PD-1 mRNA表達(dá)水平進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。反應(yīng)體系:cDNA 1 μL、熒光定量檢測(cè)反應(yīng)混合液10 μL,正、反向引物各0.6 μL,以去離子水補(bǔ)足至20 μL。PD-L1引物序列:正向5′-TAGCTAGCTAGTTAGTC-3′,反向5′-TCCAGGCTAGCTAGCTTA-3′;PD-1引物序列:正向5′-CGTAGGCGTTATGCGTATT-3′,反向5′-ATGCTATGCGTAGTAGCGT-3′。在熒光定量PCR儀上設(shè)置反應(yīng)程序:95 ℃ 3 min,而后95 ℃ 15 s、特異性退火溫度(PD-L1 60.0 ℃、PD-1 62 ℃、β-actin 62.0 ℃)25 s、72 ℃ 30 s,重復(fù)40個(gè)循環(huán),反應(yīng)結(jié)束后得到循環(huán)曲線及循環(huán)閾值(Ct)。內(nèi)參β-actin引物序列:正向5′-TAGCGTATGCGTTAGCTGA-3′,反向5′-ATTGCTGGCTGATTGCGTA-3′。按照公式2-ΔΔCt計(jì)算PD-L1、PD-1的mRNA表達(dá)水平。

1.3化療方案及療效評(píng)價(jià) 根據(jù)指南[1-2]給予患者FOLFOX系統(tǒng)性化療方案,共治療6個(gè)周期,化療后參照指南、按照實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、疾病穩(wěn)定(SD)和疾病進(jìn)展(PD),計(jì)算客觀有效率、疾病控制率。客觀有效率=CR率+PR率,疾病控制率=CR率+PR率+SD率。

1.4手術(shù)預(yù)后的評(píng)價(jià) 伴肝轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者化療后進(jìn)行結(jié)直腸癌原發(fā)灶和肝轉(zhuǎn)移灶一期同步切除,手術(shù)后進(jìn)行隨訪,隨訪截止時(shí)間為2022年4月30日,隨訪的終點(diǎn)事件為腫瘤發(fā)生復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移,據(jù)此計(jì)算無進(jìn)展生存時(shí)間。

2 結(jié) 果

2.1伴肝轉(zhuǎn)移與無轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌組織MSI狀態(tài)比較 伴肝轉(zhuǎn)移的194例結(jié)直腸癌患者結(jié)直腸癌組織MSI-H 11例(MSI-H率為5.67%),MSI-L 70例(MSI-L率為36.08%),MSS 113例(MSS率為58.25%);無轉(zhuǎn)移的278例結(jié)直腸癌患者結(jié)直腸癌組織MSI-H 56例(MSI-H率為20.14%),MSI-L 84例(MSI-L率為30.22%),MSS 138例(MSS率為49.64%)。經(jīng)檢驗(yàn),伴肝轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌組織MSI-H率低于無轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌組織,MSI-L率、MSS率高于無轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌組織,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2伴肝轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者M(jìn)SI-H組、MSI-L組、MSS組臨床病理特征比較 伴肝轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者中,MSI-H組、MSI-L組、MSS組患者性別、年齡、原發(fā)灶位置比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目≥4個(gè)、肝轉(zhuǎn)移數(shù)目≥2個(gè)、化療前癌胚抗原(CEA)水平比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);兩兩比較顯示,MSL-H組低分化的比例、黏液腺癌的比例、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目≥4個(gè)的比例、肝轉(zhuǎn)移數(shù)目≥2個(gè)的比例、化療前CEA水平均高于MSI-L組和MSS組(P<0.05)。見表1。

表1 MSI-H組、MSI-L組、MSS組臨床病理特征比較

2.3伴肝轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者中MSI-H組、MSI-L組、MSS組原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶內(nèi)PD-L1、PD-1表達(dá)水平的比較 伴肝轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者中3組原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶內(nèi)PD-L1、PD-1表達(dá)水平比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩兩比較顯示,MSI-H組原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶內(nèi)PD-L1、PD-1的mRNA表達(dá)水平均高于MSS組、MSI-L組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 伴肝轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者中MSI-H組、MSI-L組、MSS組原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶內(nèi)PD-L1、PD-1表達(dá)水平比較

2.4MSI-H組、MSI-L組、MSS組化療近期療效比較 MSI-H組化療近期療效客觀有效率、疾病控制率均低于MSI-L組、MSS組(P<0.05)。見表3。

表3 MSI-H組、MSI-L組、MSS組化療近期療效比較[n(%)]

2.5MSI-H組、MSI-L組、MSS組預(yù)后比較 隨訪過程中,MSI-H組11例患者全部發(fā)生進(jìn)展,MSI-L組60例患者發(fā)生進(jìn)展,MSS組90例患者發(fā)生進(jìn)展。經(jīng)Log-rank檢驗(yàn),MSI-H組的累積無進(jìn)展生存率低于MSI-L組和MSS組(P<0.05);MSI-H組與MSI-L組化療的累積無進(jìn)展生存率比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 K-M生存曲線

3 討 論

結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展過程中存在基因組不穩(wěn)定,包括MSI、染色體不穩(wěn)定及CpG島甲基化三方面[6],其中MSI在腫瘤發(fā)生、病理進(jìn)展、預(yù)后轉(zhuǎn)歸中均發(fā)揮了重要作用[7-8]。MSI的發(fā)生與錯(cuò)配修復(fù)基因突變或異常表達(dá)導(dǎo)致的錯(cuò)配修復(fù)蛋白表達(dá)缺失有關(guān),根據(jù)基因突變數(shù)量不同MSI被分為MSI-H、MSI-L和MSS,準(zhǔn)確評(píng)估MSI的狀態(tài)能夠?yàn)橹朴喚珳?zhǔn)的結(jié)直腸癌治療策略提供依據(jù)。

近些年,臨床學(xué)者陸續(xù)開展了MSI與結(jié)直腸癌的相關(guān)研究,多數(shù)研究均支持早期結(jié)直腸癌中MSI-H的發(fā)生率高于晚期結(jié)直腸癌[7-8]。本研究對(duì)發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的晚期結(jié)直腸癌和無轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌進(jìn)行了MSI狀態(tài)檢測(cè)和比較,結(jié)果顯示轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的原發(fā)灶內(nèi)MSI-H率明顯降低(P<0.05),MSI-L率及MSS率明顯升高(P<0.05),這一結(jié)果與既往研究結(jié)果一致[7-9]。目前,MSI-H影響Ⅰ、Ⅱ期結(jié)直腸癌病理進(jìn)展及預(yù)后的研究結(jié)果已被廣泛接受,Ⅰ、Ⅱ期結(jié)直腸癌MSI-H往往提示預(yù)后生存良好,可能原因是MSI-H會(huì)促進(jìn)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞、Th1淋巴細(xì)胞的浸潤并促進(jìn)癌細(xì)胞的清除[10-11]。但目前關(guān)于晚期結(jié)直腸癌中MSI與病情的關(guān)系尚存爭(zhēng)議。

當(dāng)結(jié)直腸癌進(jìn)展至晚期后,MSI-H造成的病灶內(nèi)淋巴細(xì)胞大量浸潤會(huì)代償性增加免疫檢查點(diǎn),促進(jìn)癌細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸,并形成了有利于癌細(xì)胞生長的微環(huán)境,在此基礎(chǔ)上腫瘤病灶不斷生長并出現(xiàn)相應(yīng)病理特征的改變[12-13]。本研究結(jié)果顯示,與MSI-L和MSS的伴肝轉(zhuǎn)移晚期結(jié)直腸癌患者比較,MSI-H患者的低分化和黏液腺癌比例更高、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目和肝轉(zhuǎn)移數(shù)目更多、CEA水平更高(P<0.05)。另外,目前關(guān)于MSI狀態(tài)的研究認(rèn)為,MSI-L和MSS在生物學(xué)特征和臨床特征上具有高度相似性,因而常常被歸為一類,本研究對(duì)MSI-L患者和MSS患者的比較也未發(fā)現(xiàn)腫瘤病理特征的差異。以上結(jié)果表明,MSI-H促進(jìn)了伴肝轉(zhuǎn)移晚期結(jié)直腸癌的病理進(jìn)展,包括分化程度變化、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移增多、CEA分泌增加。

研究認(rèn)為,MSI-H在早期結(jié)直腸癌和晚期結(jié)直腸癌中的生物學(xué)作用均與腫瘤局部的免疫應(yīng)答有關(guān),MSI-H在結(jié)直腸癌早期促進(jìn)淋巴細(xì)胞浸潤、加強(qiáng)抗腫瘤免疫應(yīng)答,在結(jié)直腸癌晚期代償性增加免疫檢查點(diǎn)、削弱抗腫瘤免疫應(yīng)答、促進(jìn)癌細(xì)胞的免疫逃逸[12-13]。有研究顯示,結(jié)直腸癌免疫逃逸可能與PD-L1/PD-1途徑有關(guān),PD-1是一個(gè)負(fù)性共刺激受體,PD-L1與受體PD-1結(jié)合后能夠向下游傳導(dǎo)抑制性信號(hào),最終實(shí)現(xiàn)對(duì)淋巴細(xì)胞分化成熟及增殖的抑制效應(yīng)[14]。結(jié)直腸癌中PD-L1和PD-1高表達(dá)與病理進(jìn)展有關(guān),二者也是預(yù)后不良的相關(guān)因素[15-16]。本研究結(jié)果顯示,MSI-H組患者原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶中PD-L1和PD-1水平均高于MSI-L組和MSS組,提示MSI-H在伴肝轉(zhuǎn)移晚期結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展過程中促進(jìn)PD-L1/PD-1的表達(dá),進(jìn)而可能抑制抗腫瘤免疫應(yīng)答、促進(jìn)癌細(xì)胞的免疫逃逸。

對(duì)于確診結(jié)直腸癌時(shí)已發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的患者,指南推薦采用系統(tǒng)性化療方案進(jìn)行輔助化療,而后進(jìn)行原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶的切除手術(shù)[1-2]。一項(xiàng)胃癌相關(guān)的臨床研究證實(shí),錯(cuò)配修復(fù)MLH1表達(dá)缺失與化療耐藥相關(guān),提示MSI狀態(tài)可能影響化療療效,進(jìn)而影響預(yù)后[17]。本研究對(duì)伴肝轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者進(jìn)行新輔助化療,通過近期療效的評(píng)價(jià)可知:MSI-H患者的客觀有效率、疾病控制率均低于MSI-L患者和MSS患者(P<0.05),提示MSI-H會(huì)影響伴肝轉(zhuǎn)移的晚期結(jié)直腸癌患者的化療療效。在新輔助化療完成后進(jìn)行手術(shù)切除,通過隨訪可知MSI-H患者的累積無進(jìn)展生存率均低于MSI-L患者和MSS(P<0.05),提示MSI-H降低會(huì)對(duì)伴肝轉(zhuǎn)移的晚期結(jié)直腸癌患者的預(yù)后產(chǎn)生不利影響。

綜上所述,伴肝轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌原發(fā)灶內(nèi)MSI-H率降低,MSI-H與分化程度變化、淋巴結(jié)和肝臟轉(zhuǎn)移增加、CEA分泌增多等病理進(jìn)展有關(guān),也與PD-L1/PD-1表達(dá)升高、化療近期療效和遠(yuǎn)期預(yù)后不佳有關(guān)。本研究結(jié)果為認(rèn)識(shí)MSI狀態(tài)在轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌中的作用提供了一定依據(jù),提示檢測(cè)MSI對(duì)評(píng)估轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌病理進(jìn)展和預(yù)后、制訂精準(zhǔn)治療方案具有積極價(jià)值。