血清miR-29b、miR-371表達與中晚期肝細胞癌患者Th1/Th2平衡、臨床病理特征及預后的關系*

張燕燕,江龍龍,趙春燕,尹倫財,卿 松

重慶市大足區人民醫院:1.腫瘤科;2.普外科,重慶 402360

肝細胞癌(HCC)是全球第五大常見惡性腫瘤,是癌癥相關死亡率的第三大原因[1]。HCC早期缺少特異性表現,確診時多處于中晚期,喪失最佳根治手術治療時機,5年生存率小于18%[2]。目前中晚期HCC患者的治療以肝動脈化療栓塞(TACE)為主,在阻斷腫瘤肝動脈血供同時,配合局部化療藥物殺傷腫瘤,能延長患者生存時間[3]。但腫瘤組織缺氧狀態仍會誘導缺氧誘導因子表達,促進腫瘤血管新生,導致腫瘤復發轉移及患者不良預后[4]。因此,深入研究中晚期HCC疾病機制,尋找新的中晚期HCC預后相關標志物,具有重要意義。微小核糖核酸是長度20～25個核苷酸的非編碼RNA分子,參與機體發育、分化及腫瘤等多種生理病理過程調節。近年來發現,miR-29b、miR-371是在HCC癌組織中差異性表達較為顯著的miRNA[5-6],二者可影響HCC腫瘤微環境中免疫細胞的功能、輔助性T細胞1型(Th1)及2型(Th2)細胞因子平衡[7-8],促進HCC進展。本研究通過檢測HCC血清miR-29b、miR-371表達水平,分析其與臨床病理特征、Th1/Th2平衡及預后的關系,以期為中晚期肝癌患者臨床治療和預后改善提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年1月至2019年2月本院收治的98例HCC患者作為HCC組。納入標準:(1)經病理穿刺活檢組織學、計算機斷層掃描(CT)、磁共振成像(MRI)等影像學檢查明確診斷為HCC,診斷符合《原發性肝癌診療規范(2017年版)》[9],符合巴薩羅那分期(BCLC)[10]標準中的B、C期;(2)患者不適宜或不愿意接受手術治療,同時接受TACE治療;(3)初次診治,既往無放化療等治療史;(4)臨床資料完整。排除標準:(1)伴嚴重心、肺、腎等臟器功能不全;(2)肝功能Child-Pugh評分C級;(3)肝內病灶數目>3個,腫瘤廣泛遠處轉移,卡氏體力狀態(KPS)評分<70分,預計生存期<3個月;(4)合并血液系統疾病等。HCC組男63例,女35例;年齡33～78歲,平均(55.1±7.8)歲;Child-Pugh分級:A級58例,B級40例;KPS評分:>90分70例,70～90分 28例;術前甲胎蛋白(AFP):<400 μg/L 67例,≥400 μg/L 31例;CT或MRI檢查測量腫瘤最大徑(多病灶時選取最大者測量腫瘤最大徑)≤5 cm 38例,>5 cm 60例;病灶個數:1個54例,≥2個44例。另選取同期在本院就診或體檢的52例肝臟良性疾病患者為疾病對照組,60例健康體檢者為對照組。疾病對照組男32例,女20例;年齡33～78歲,平均(54.8±7.6)歲;慢性乙型肝炎25例,酒精性肝病13例,脂肪肝14例。對照組男39例,女21例;年齡32～77歲,平均(54.5±7.5)歲。3組年齡、性別等一般資料比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。本研究經本院醫學倫理委員會批準通過。所有受試者及家屬對本研究知情同意并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1血清miR-29b、miR-371檢測 采集研究對象空腹靜脈血約5 mL,3 000 r/min離心5 min分離上層血清,-80 ℃冰箱保存。用Trizol法提取血清總RNA,Narodrop1000(美國賽默飛世爾科技公司)檢測RNA純度,A260/A280在1.9～2.1為符合要求。采用RNA逆轉錄試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]將RNA逆轉錄為cDNA,反應條件為42 ℃ 30 min,然后進行實時熒光定量PCR(RT-qPCR)。miR-29b的正向引物序列為5′-GCGTAGCACCATTTGAAATC-3′,反向引物序列為5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′;miR-371正向引物序列為5′-GCAGTGGCTGAACCAAGGAGAC-3′,反向引物序列為 5′-GCCGTGAGCTGTGCAGGTG-3′;內參U6的正向引物序列為5′-AATGGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3′,反向引物序列為5′-TCGCTCCTGGAAGATGGTGATGG-3′。PCR總反應體系為10 μL:cDNA 1 μL,正、反向引物各1 μL、SYBR Green Premix 5 μL,雙蒸水2 μL。反應條件:95 ℃預變性5 min;95 ℃變性15 s,60 ℃退火60 s,72 ℃延伸15 s,共40個循環。采用2-ΔΔCt法計算miR-29b、miR-371的相對表達水平。根據miR-29b、miR-371相對表達水平的平均值,將HCC組分為miR-29b低表達組、高表達組,以及miR-371低表達組、高表達組。

1.2.2Th1/Th2型細胞因子檢測 采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清γ干擾素(IFN-γ)、白細胞介素(IL)-2、IL-4及IL-10水平。試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。實驗步驟嚴格按試劑盒說明書進行。

1.2.3隨訪 所有患者出院后開始進行隨訪,以電話、門診復查方式進行隨訪,隨訪內容為患者生存情況,出院后第1年每3個月隨訪1次,第2～3年每半年隨訪1次。隨訪時間截至2022年3月1日或患者死亡。

2 結 果

2.13組血清miR-29b、miR-371水平與Th1/Th2型細胞因子比較 與疾病對照組及對照組相比,HCC組血清miR-29b、IFN-γ、IL-2水平明顯較低,miR-371、IL-4、IL-10水平明顯較高,差異均有統計學意義(P<0.05),而疾病對照組與對照組間血清miR-29b、miR-371、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10水平差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 3組血清miR-29b、miR-371水平與Th1/Th2型細胞因子比較

2.2中晚期HCC患者血清miR-29b、miR-371與Th1/Th2型細胞因子的相關性 Pearson相關分析顯示,中晚期HCC患者血清miR-29b與IFN-γ、IL-2表達呈正相關(P<0.001),與IL-4、IL-10呈負相關(P<0.001);血清miR-371與IFN-γ、IL-2表達呈負相關(P<0.001),與IL-4、IL-10呈正相關。見表2。

表2 中晚期HCC患者血清miR-29b、miR-371與Th1/Th2型細胞因子的相關性

2.3血清miR-29b、miR-371水平與中晚期HCC患者臨床病理特征的關系 不同肝功能Child-Pugh分級、腫瘤最大徑及病灶個數的HCC患者血清miR-29b、miR-371表達差異有統計學意義(P<0.05),不同性別、年齡、KPS評分、術前甲胎蛋白(AFP)的HCC患者血清miR-29b、miR-371表達差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 血清miR-29b、miR-371水平與臨床病理特征的關系

2.4血清miR-29b、miR-371水平對中晚期HCC患者生存預后的影響 98例HCC組患者隨訪時間7～36個月,平均(23.2±3.7)個月,隨訪過程中失訪2例,患者隨訪期內死亡44例。根據miR-29b、miR-371相對表達水平的平均值,最終miR-29b低表達組50例,高表達組48例,miR-371低表達組47例,高表達組51例。miR-29b低表達組、高表達組平均生存期分別為(18.1±3.2)、(28.2±3.7)個月,Log-rank檢驗結果顯示,miR-29b低表達組患者的累積總體生存率顯著低于miR-29b高表達組(Log-rankP<0.05)。miR-371低表達組、高表達組平均生存期分別為(19.0±3.9)、(27.5±4.1)個月,miR-371低表達組患者的累積總體生存率顯著高于miR-371高表達組(Log-rankP<0.05)。

2.5單因素及多因素COX回歸分析影響中晚期HCC患者預后的因素 以中晚期HCC患者預后為因變量,賦值(0=生存,1=死亡,t=生存期)并建立COX比例風險回歸模型?；貧w過程采用逐步后退法,以進行自變量的選擇和剔除,設定α剔除=0.10,α入選=0.05。將性別(賦值:0=男,1=女)、年齡(賦值:0=≤60歲,1=>60歲)、Child-Pugh分級(賦值:0=A級,1=B級)、KPS評分(賦值:0=≤90分,1=>90分)、術前AFP(賦值:0=<400 μg/L,1=≥400 μg/L)、腫瘤最大徑(賦值:0=<5 cm,1=>5 cm)、病灶個數(賦值:0=1個,1=≥2個)、miR-29b(賦值:0=高表達,1=低表達)、miR-371(賦值:0=低表達,1=高表達)引入回歸方程,結果顯示,病灶個數、腫瘤最大徑、miR-29b、miR-371是影響HCC患者生存預后的因素(P<0.05),見表4。將上述單因素分析結果中P<0.10的4個因素作為自變量,多因素COX回歸分析結果顯示,病灶個數≥2個、腫瘤最大徑>5 cm、miR-29b低表達、miR-371高表達均是影響HCC患者預后的獨立危險因素(P<0.05)。見表5。

表4 HCC患者預后的單因素

表5 多因素COX回歸分析影響HCC患者預后的因素

3 討 論

HCC是原發性肝癌中最常見的類型,我國乙型肝炎患病率較高,HCC風險較高,每年發病例數約16萬例,死亡例數約14萬例,嚴重威脅人們的身體健康[11]。早期HCC通常可通過手術進行治愈性治療,而對于中晚期HCC患者,即使經積極TACE等綜合治療后,腫瘤仍可發生復發轉移,導致患者不良生存預后。因此,深入研究HCC腫瘤發生、發展的機制,尋找能夠判斷中晚期HCC患者預后的生物標志物,具有重要的臨床價值。

miR-29b位于人類染色體7q32.3,其作為一種miRNA,能夠結合到下游靶基因的3′-非編碼區(3′UTR),降低靶基因信使RNA的穩定性,抑制下游基因表達。近年研究發現,miR-29b在乳腺癌及肺癌等惡性腫瘤中異常表達升高或降低,通過影響Wnt、AKT等信號通路,參與腫瘤的發生、發展[12]。本研究中,中晚期HCC患者血清miR-29b表達明顯降低,并且與肝功能Child-Pugh分級、腫瘤最大徑及腫瘤個數等臨床病理特征有關,提示HCC中miR-29b的表達下調可能參與促進HCC的腫瘤進展。miR-29b的表達下調可能與上游長鏈非編碼RNA(lncRNA)的表達調控有關。研究表明,lncRNA HCP5能夠結合并抑制miR-29b的表達,繼而促進DNA甲基轉移酶3的表達,激活下游AKT信號通路,促進HCC患者腫瘤細胞的增殖及轉移[13]。有研究發現,miR-29b的表達能夠抑制基質金屬蛋白酶9(MMP-9)的表達,miR-29b的表達下調導致腫瘤細胞MMP-9的表達顯著增加,促進腫瘤細胞的侵襲和轉移[14]。因此,HCC中miR-29b可能作為一種抑癌因子,發揮腫瘤抑制的功能。本研究結果證實,miR-29b低表達的HCC患者生存預后較差,是患者不良預后的獨立因素。有學者發現,肝癌細胞中miR-29b的表達下調促進自噬相關基因LC3B的表達,誘導腫瘤細胞對化療藥物及靶向藥物索拉非尼的耐藥性形成[15]。亦有報道顯示,miR-29b的表達升高能夠增加骨肉瘤細胞對化療藥物的敏感性,增強化療療效[14]。因此,HCC中miR-29b的表達降低可能通過降低腫瘤細胞對化療藥物的治療的敏感性,導致患者不良預后。臨床上可根據血清miR-29b水平對HCC患者的臨床預后進行評估,并采取相應的治療和隨訪方案,以改善患者的生存質量及預后。

miR-371位于人類染色體19q13.42,其作為一種miRNA,參與調節細胞增殖、分化、凋亡和衰老等生物學過程。研究表明,miR-371在胃癌及胰腺癌等腫瘤患者中表達顯著升高,其通過促進細胞周期G1/S期的轉換促進腫瘤細胞的惡性增殖[16]。本研究結果發現,HCC患者血清miR-371表達顯著升高,并且與Child-Pugh分級、腫瘤最大徑及腫瘤個數有關,表明miR-371的表達升高參與促進中晚期HCC患者的腫瘤進展。分析其原因,腫瘤miR-371表達上調與染色體重排有關。研究發現,19q13.4染色體重排的腫瘤細胞中RNA聚合酶Ⅱ片段表達增加,導致miR-371基因簇過度表達[17]。此外,miR-371能夠通過抑制抑癌基因磷酸酶和張力蛋白同系物的表達,促進肝腫瘤細胞的增殖及遷移轉移能力[6]。因此,HCC中miR-371可能作為一種腫瘤促進因子,發揮促進HCC腫瘤進展的作用。本研究發現,miR-371高表達的HCC患者生存預后較差,是患者不良預后的獨立危險因素,提示臨床醫生可根據患者血清miR-371水平對患者的臨床預后進行評估,指導臨床治療。

目前研究認為,HCC的發生發展與腫瘤微環境的改變密切相關,腫瘤微環境中Th1/Th2型細胞因子平衡失調不僅直接促進HCC的腫瘤進展,還能通過抑制微環境中免疫細胞的正常功能,發揮腫瘤促進作用[18]。IL-2和IFN-γ是腫瘤微環境中Th1型細胞因子,能夠通過增強腫瘤殺傷T淋巴細胞的腫瘤殺傷功能,發揮抗腫瘤效應,IL-4和IL-10屬于Th2型細胞因子,能夠通過促進巨噬細胞向M2型轉化,介導腫瘤細胞免疫逃逸,發揮腫瘤促進效應[19]。本研究中,HCC組患者血清IFN-γ、IL-2水平降低,而IL-4、IL-10水平明顯升高,提示中晚期HCC患者存在Th1/Th2型細胞因子漂移的現象,患者機體處于免疫抑制的狀態。相關性分析發現,血清miR-29b、miR-371表達與Th1/Th2型細胞因子均具有相關性,表明miR-29b、miR-371可能通過影響Th1/Th2型細胞因子漂移,參與促進HCC進展。研究表明,IFN-γ表達受miR-29b的表達調控,腫瘤中miR-29b表達降低導致CD4+T淋巴細胞DNA的高甲基化,抑制IFN-γ等Th1型細胞因子的表達及分泌[20]。有研究發現,miR-371的表達升高能夠促進CD4+T淋巴細胞中Runt相關轉錄因子3的表達,抑制Th1型細胞因子的分泌,同時促進Th2型細胞因子的產生[8],Th2型細胞因子通過抑制機體抗腫瘤免疫功能,如抑制腫瘤殺傷性T淋巴細胞的腫瘤殺傷功能,促進腫瘤的轉移[21]。

綜上所述,中晚期HCC患者血清miR-29b水平降低,miR-371水平升高,二者表達與肝功能Child-Pugh分級、腫瘤最大徑及腫瘤個數及Th1/Th2型細胞因子水平有關,二者可能通過影響HCC腫瘤免疫微環境中Th1/Th2型細胞因子的平衡狀態,促進HCC進展。但本研究尚存在不足之處,樣本量有限,并且未對中晚期HCC患者治療前后血清miR-29b、miR-371水平動態變化進行監測,因此,有待今后擴大樣本量進行深入研究。