ATG5基因單核苷酸多態性與中國西南地區漢族人群肺結核易感性的相關性研究

姜閔慧,周 娟,趙珍珍,周 易△

1.成都華西精準醫學產業技術研究院有限公司,四川成都 610000;2.四川大學華西醫院實驗醫學科,四川成都 610041

結核病是嚴重影響公共衛生的重大傳染病,是僅次于新型冠狀病毒的第二大“單一感染源”致死原因。其中,肺結核占所有結核病的80%以上。結核分枝桿菌是導致結核病的主要因素,感染結核分枝桿菌的人數約占世界總人口的四分之一[1]。但是由于個體的差異,只有5%～10%發展為活動性肺結核[2]。宿主遺傳因素在結核病易感性中起著重要作用[3]。宿主遺傳因素對結核病感染人群的免疫反應和表型變異的貢獻高達71%[4]。然而,結核分枝桿菌感染機體的發病機制在很大程度上仍然未知,進一步研究結核病感染的有關遺傳因素,將有助于了解結核病的發病機制。

自噬是一種細胞內保守的降解過程,在細胞的更新、循環中起著核心作用,以維持細胞內營養物質和能量的穩態[5]。有研究表明,自噬和自噬相關基因缺失的小鼠更容易感染結核分枝桿菌[6-7]。參與自噬途徑的基因變異可能會影響宿主對結核分枝桿菌感染的應答,這提示自噬相關基因多態性可能與結核病易感性有關[8-9]。自噬相關基因-5(ATG5)主要參與自噬小體的雙層膜彎曲,對自噬的發生起決定性作用,可調節自噬體的形成。然而,ATG5與肺結核易感性相關研究較少。本研究采用病例對照設計對我國西南地區漢族人群ATG5基因的9個單核苷酸多態性(SNP)進行分型,以探討ATG5基因多態性與結核病的相關性。

1 資料與方法

1.1一般資料 隨機納入2014年1月至2016年2月四川大學華西醫院的900例活動性肺結核患者(肺結核組)和1 534例健康對照者(健康對照組)進行研究。健康對照組診斷與納入標準:(1)未感染過結核病;(2)痰涂片及結核分枝桿菌核酸檢測等結果為陰性;(3)體檢結果為健康個體;(4)影像學檢查結果顯示為正常;(5)中國西南地區漢族人群。肺結核組納入標準:(1)根據我國肺結核病診斷標準[10],具有結核病的相關癥狀及臨床表現,結核分枝桿菌病原學檢查(涂片抗酸桿菌檢查、結核分枝桿菌培養、菌種鑒定及藥敏試驗、結核分枝桿菌核酸檢測)、病理學、影像學、血清學、結核菌純蛋白衍生物(PPD)試驗、γ干擾素釋放試驗等方法試驗結果為陽性;(2)中國西南地區漢族人群。排除標準:(1)其他呼吸系統疾病,如肺部感染、支氣管擴張、慢性阻塞性肺疾病、肺心病、肺癌等;(2)其他感染性疾病,如艾滋病、支原體/衣原體感染、肝炎病毒等;(3)自身免疫性疾病,如系統性紅斑狼瘡、系統性血管炎等;(4)合并其他基礎疾病;(5)使用過免疫抑制劑或增強劑。本研究獲得四川大學華西醫院臨床試驗與生物醫學倫理專委會批準[審批號:2014年審(198)號)],所有受試者均簽署知情同意書,自愿參與研究。本研究的所有數據均來自四川大學華西醫院檢驗科“結核病研究”生物庫。

1.2方法 采集受試者5 mL乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝全血,血液標本均儲存于生物資源庫中。采用濾柱法進行全血基因組DNA提取(Qiagen,德國),并采用新型多重酶連接反應(iMLDR)基因分型技術對ATG5基因的9個SNP位點(rs10484575、rs11754416、rs9486302、rs2284193、rs117827198、rs633724、rs79454666、rs77441653、rs3804338)進行基因分型。實驗過程中以雙蒸水為陰性對照,并對標本進行隨機分組。同時,對隨機選取的10%的樣品進行重復基因分型,結果為符合率100%,確保基因分型準確。

2 結 果

2.1研究人群基本特征 肺結核組男542例(60.22%)、女358例(39.78%),平均年齡(42.5±14.5)歲;健康對照組男821例(53.52%)、女713例(46.48%),平均年齡(38.0±14.2)歲。肺結核組男性比例高于健康對照組,平均年齡高于對照組,差異均有統計學意義(P=0.001)。

2.2ATG5基因SNP分布情況 ATG5基因的9個SNP滿足Hardy-Weinberg平衡(HWE-P>0.05),9個SNP位點的基本信息及分布情況見表1。

表1 9個SNP基本信息及分布情況

2.3ATG5基因單核苷酸多態性與肺結核易感性的關聯分析 肺結核組和健康對照組等位基因分布,經過年齡和性別校正后,ATG5基因的位點rs10484575、rs11754416等位基因和基因型頻率分布差異有統計學意義(P=0.011、0.035)。在3種遺傳模型中,對于rs10484575位點,在加性模型下顯示與肺結核相關,提示AA基因型攜帶者患肺結核的風險降低;在顯性模型下顯示與肺結核相關,提示AA+GG基因型患肺結核的風險降低。對于rs11754416位點,在加性模型下顯示與結核病相關,提示AA基因型攜帶者患肺結核的風險降低;在顯性模型下顯示與肺結核相關,提示AA+GG基因型患肺結核的風險降低。見表2、3。

表2 ATG5基因的9個SNP位點在肺結核組和健康對照組之間的等位基因和基因型分析

2.4ATG5基因多態性的單倍型與肺結核易感性關聯性分析 用Haploview 4.2軟件對ATG5基因上9個SNP位點進行連鎖不平衡分析,r2>80%視為強連鎖不平衡,其中rs10484575、rs11754416之間存在強連鎖不平衡(r2>96%)。本研究構建了一個由rs10484575和rs11754416組成的LD圖(圖1),2個SNP形成GG、AA 2種單倍型。構建的兩種單倍型模型分布差異有統計學意義(P<0.05)。形成的單倍型GG個體患肺結核的風險增高(OR=1.407),形成的單倍型AA個體患肺結核的風險降低(OR=0.720)。見表4。

表3 ATG5基因的9個SNP位點在肺結核組和健康對照組之間的遺傳模型分析

圖1 ATG5基因上9個SNP之間連鎖不平衡示意圖

表4 rs10484575、rs11754416形成的單倍型與結核病的關系

3 討 論

自噬是一種細胞內分解代謝過程,有助于維持體內平衡,并通過溶酶體降解過程去除病原體[11]。研究表明,自噬是一種關鍵保護過程,可限制結核分枝桿菌在宿主細胞中生長[12～13],自噬基因IRGM1多態性與結核分枝桿菌的保護性機制有關[14-15]。既往研究中,一些與自噬密切相關的基因(如P2X7、VDR、NOD2、TLR8)已被作為結核病患者的候選檢測基因[16]。在東南亞[17]、印度[18]受試者中發現自噬基因CP2X7多態性與肺結核易感性密切相關。自噬與分枝桿菌有復雜的相互作用:它既影響直接抗分枝桿菌宿主防御機制,也影響分枝桿菌感染的炎癥反應,在清除結核分枝桿菌中起著關鍵作用[16]。因此自噬在結核分枝桿菌感染中的作用值得關注。

自噬相關基因ATG5,在細胞自噬與凋亡的發生和發展中起重要的調控作用,被稱為細胞自噬和凋亡的轉換“開關”[19]。有研究證實,西南地區人群中,PRDM1和ATG5基因間的SNP位點rs548234與原發性肺結核有顯著關聯,在感染結核桿菌的小鼠模型中,敲除 ATG5后小鼠存活不足 30 d,表明ATG5在抵抗結核桿菌時發揮了關鍵保護效應[20]。另外也有研究證明,miR-1958 通過作用于ATG5 的3′UTR 區調節自噬,進而抑制結核桿菌的生長;相反,miR-1958 降低可增加 ATG5 表達,調節自噬活性,最終影響結核桿菌的存活[21]。因此本研究推測ATG5基因多態性可能與結核病易感性相關。本研究結果顯示,位點rs10484575(位于ATG5基因下游)的攜帶A等位基因的個體患肺結核的風險潛在性降低;在加性模型、顯性模型rs10484575的AA基因型對結核病易感性顯著降低。盡管采用了不同的分析方法,但在rs10484575位點上觀察到相似的統計學意義,表明SNP rs10484575可能是中國漢族西南地區肺結核感染的一個易感位點。位點rs11754416位于ATG5基因內含子上,SNP rs11754416 A等位基因可能是肺結核感染的保護因素,在加性模型、顯性模型下顯示出AA基因型對結核病易感性顯著降低。同時,2個位點(rs10484575、rs11754416)之間存在強連鎖不平衡(r2>96%),構建的2種單倍型模型的分布差異均有統計學意義(P=0.011、0.016),形成的單倍型GG個體患肺結核的風險增高(OR=1.407),形成的單倍型AA個體患肺結核的風險降低(OR=0.720)。這與單個SNP關聯分析一致,為這2個SNP對肺結核感染起保護作用提供了依據。

本研究的不足之處在于:納入的對象樣本量相對較大,但納入研究的人群僅限于中國西南地區漢族,這可能會減少由群體混合引起的選擇偏差,但也可能在其他種族人群中得到不同的結果。另外,本研究僅進行了ATG5基因上9個SNP位點與結核病易感性的關聯研究,未進一步進行基因與環境、基因與基因之間相互作用的研究。

綜上所述,本研究發現ATG5基因的rs10484575攜帶A等位基因的個體患肺結核的風險降低、rs11754416攜帶A等位基因的個體患肺結核的風險降低,其余7個位點在中國西南地區漢族人群中與肺結核易感性沒有關聯性。后續可以進一步分析ATG5基因上多個位點突變對基因表達水平的影響,并在其他人群中進一步研究該基因與肺結核易感性之間的關系。