原發性硬化性膽管炎小鼠NK1R/TGF-β1/miR-31軸對膽汁瘀積及肝纖維化的影響

武云飛,張衛彬,楊 成,李 博

錦州市中心醫院普外二科,遼寧錦州 121000

原發性硬化性膽管炎是臨床較為常見的進行性非化膿性膽管疾病[1]。流行病學調查顯示,原發性硬化性膽管以女性多發,臨床主要以種肝內外膽管損傷、肝內膽汁淤積作為主要特征,同時合并其他自身免疫性疾病[2]。在病理學研究中,原發性硬化性膽管主要表現為肝內膽管的進行性破壞[3],進一步造成局部病灶部位的炎癥反應及纖維化,而隨著疾病的發展,最終會造成門脈高壓及肝硬化,嚴重影響患者的生命質量[4]。有研究報道指出,隨著疾病的進展,門脈高壓呈進行性進展,肝纖維化程度升高,肝功能下降[5]。神經激肽1受體(NK1R)對炎癥反應水平有一定指導意義[6]。轉化生長因子-β1(TGF-β1)是肝臟細胞病變及纖維化的重要指標。血清微小RNA-31(miR-31)最早被認為是腫瘤細胞遷移的重要指征,但是近年研究認為,miR-31對肝纖維化的不斷浸染具有積極意義[7]。本研究主要通過原發性硬化性膽管炎小鼠NK1R/TGF-β1/miR-31軸對膽汁瘀積及肝纖維化的影響,為臨床診斷及治療提供依據。

1 材料與方法

1.1實驗動物 120只雌性SPF級新生小鼠由中科院提供;體重180～217 g,平均(25.33±2.39)g;飼養條件:溫度(21±2)℃,濕度30%～70%,光照每晝夜12 h。

1.2儀器與試劑 儀器:酶標儀(DNM-9602,北京普朗新技術有限公司);臺式高速冷凍離心機(TGL20M,JTLIANGYOU);恒溫水浴箱(HH-W420/W600);PCR儀[中科瑞泰(北京)生物科技有限公司]。試劑:Trizol 試劑(上海聯碩生物科技有限公司);試劑盒(上海羅氏)。

1.3方法

1.3.1模型構建 將120只實驗小鼠隨機分為模型組、對照組、空白組3組,每組40只。模型組:腹腔注射聚肌胞苷酸(1%)建模,注射劑量5 mg/kg,每周注射2次,對實驗小鼠進行隨機病理學檢測。對照組:腹腔注射等量的生理鹽水,注射劑量同模型組。空白組:不采取任何處理措施。

1.3.2標本處理 取肝組織放入4%多聚甲醛固定中,后經乙醇脫水、石蠟包埋等步驟后,行連續切片后封閉。根據常規步驟進行Masson染色[1],鏡下觀察肝組織病理形態。

1.3.3研究方法 分別對實驗小鼠進行眼眶采血4 mL,3 000 r/min離心10 min取上清。采用酶聯免疫試驗檢測實驗小鼠血清TGF-β1、TGF-β1水平,采用熒光定量PCR(RT-qPCR)法檢測miR-31水平。操作流程嚴格按照說明書進行。

1.3.4觀察指標 比較3組實驗小鼠NK1R、TGF-β1、miR-31水平,比較無明顯纖維化組、明顯纖維化組及早期肝硬化組實驗小鼠NK1R、TGF-β1、miR-31水平,比較膽汁淤積組及非膽汁淤積組小鼠NK1R、TGF-β1、miR-31水平。

2 結 果

2.13組小鼠肝臟纖維化情況比較 取的樣本后通過Masson染色觀察3組小鼠肝組織結果變化,結果發現,空白組、對照組肝組織結構清晰,肝小葉完整,肝細胞索排列整齊,以中央靜脈為中心呈放射狀排列,匯管區僅有極少量的纖維組織。肝纖維化模型組小鼠部分肝小葉結構紊亂,有脂肪空泡、有大量炎癥細胞浸潤,并有假小葉形成,肝細胞普遍壞死,膠原纖維大量增生并形成纖維間隔。見圖1。

注:A為對照組;B為模型組;C為空白組。

2.23組小鼠NK1R、TGF-β1、miR-31水平比較 3組小鼠NK1R、TGF-β1、miR-31水平比較,差異有統計學意義(P<0.05),兩兩比較結果顯示,模型組NK1R、TGF-β1、miR-31水平高于對照組、空白組,差異均統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 3組小鼠NK1R、TGF-β1、miR-31水平比較

2.3不同肝臟纖維化情況小鼠NK1R、TGF-β1、miR-31水平比較 無明顯纖維化組、明顯纖維化組、早期肝硬化組小鼠NK1R、TGF-β1、miR-31水平差有在統計學意義,兩兩比較結果顯示,NK1R、TGF-β1、miR-31水平從高到低依次為早期肝硬化組、明顯纖維化組、無明顯纖維化組,差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 不同肝臟纖維化情況小鼠NK1R、TGF-β1、miR-31水平比較

2.4不同膽汁淤積情況小鼠NK1R、TGF-β1、miR-31水平比較 非膽汁淤積組NK1R、TGF-β1、miR-31水平低于膽汁淤積組,差異均有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 不同膽汁淤積情況小鼠NK1R、TGF-β1、miR-31水平比較

2.5相關性分析 Spearman相關性分析顯示,實驗小鼠的NK1R、TGF-β1、miR-31水平與肝臟纖維化情況(r=0.741、0.694、0.587,均P<0.001)及膽汁淤積情況(r=0.556、0.559、0.785,均P<0.001)均呈正相關。

3 討 論

肝纖維化是肝硬化前期的一種病理變化,多數造成慢性肝損害的因素均可能導致肝纖維化。在病毒感染、酒精及遺傳等各種致病因素影響下,肝細胞被破壞[8],反復性肝細胞損傷、修復,以及細胞外基質在肝臟內的沉積[9],從而引起肝臟結構和功能發生改變,進而引起肝纖維化。目前研究認為肝纖維化及初期肝硬化通過適當的治療可以得到控制和逆轉[10]。肝纖維化的診斷多采取肝臟穿刺活檢,但是肝臟活檢存在依從性不高、易受取材部位影響的局限性,而血清學指標檢測簡便、快捷,并可有效避免由于取材造成的誤差,對于患者的預后評價更加直觀[11]。

本研究結果顯示,隨著實驗小鼠肝臟纖維化程度升高,實驗小鼠NK1R、TGF-β1、miR-31水平呈上升趨勢。有研究顯示,NK1R主要反映了機體免疫細胞的活性,隨著NK1R水平升高,進一步調控局部病灶部位的SP水平,提升炎癥反應水平[12]。而在肝硬化疾病的進展中,自身免疫性細胞對于局部病灶部位的肝細胞及病毒造成損傷的肝細胞進行吞噬,加劇疾病的進展[13]。這提示在肝臟纖維病變過程中,NK1R可通過對自身免疫系統的上調作用,進一步刺激機體的自身免疫細胞的激活,對于疾病的進展具有主要意義。TGF-β1在肝細胞纖維化轉變過程中發揮著重要的作用。有研究顯示,TGF-β1是調節細胞生長及分化的重要蛋白[14]。而在本研究中,隨著肝臟細胞的不斷纖維化病變,抑制IL-3、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)所誘導小鼠造血前體細胞和長期骨髓液體培養(LTBMC)的集落形成[15],并降低巨核細胞對IL-3和CSF的反應性,進一步造成病變細胞自身吞噬,而在不同膽汁淤積情況的分析中,隨著膽汁在肝細胞內的不斷淤積,自身免疫細胞對于局部病灶部位的吞噬細胞對于損傷細胞的修復不斷增強,而在此過程中造成的肝細胞的損傷也在升高,局部炎癥反應呈現級聯反應,進一步促進TGF-β1水平升高。miR-31最早在腫瘤細胞中發現,在肝臟細胞的纖維化的發展中主要通過NK1R、TGF-β的協同作用,進而導致肝細胞的壞死[16]。本研究結果顯示,NK1R、TGF-β、miR-31與肝細胞內的膽汁淤積及肝臟纖維化的疾病進程呈正相關。但是,本研究還存在一定的局限性,由于納入的樣本量較小,有待進行大樣本研究進一步驗證。

原發性硬化性膽管炎小鼠的NK1R、TGF-β1、miR-31和膽汁瘀積、肝纖維化程度均升高,且NK1R、TGF-β1、miR-31升高與膽汁瘀積及肝纖維化升高呈正相關,可為臨床診斷提供一定的依據。