葉面噴施硒對紫色小麥鎘積累的影響

余林科，楊昕玥，徐小遜，2*，王貴胤，2，楊占彪，張世熔，2

（1.四川農(nóng)業(yè)大學環(huán)境學院，成都 611130；2.四川省土壤環(huán)境保護重點實驗室，成都 611130）

鎘（Cd）是土壤重金屬污染元素之一，隨著工農(nóng)業(yè)加速發(fā)展，大量含Cd廢物通過工業(yè)廢氣沉降、廢水排放、化肥施用等方式進入農(nóng)業(yè)土壤[1]。土壤中過量的Cd 會破壞植物細胞結構，抑制植物的光合作用以及對養(yǎng)分的吸收和運輸，進而影響植物的正常生長[2]。此外，Cd 的流動性很強，極易通過植物富集作用進入食物鏈，對人體健康構成威脅[3]。小麥作為最主要的糧食作物之一，在世界范圍內被廣泛種植，因此，開發(fā)降低小麥Cd污染風險的技術措施很有必要。

減少作物Cd 積累的途徑主要包括種植低Cd 積累品種[4-5]，采取改良灌溉方式、施用功能性肥料、葉面噴施阻控劑等農(nóng)藝措施[6-7]，以及施行土壤改良措施[8-9]等。葉面噴施阻控技術具有操作方便、效率高、環(huán)境友好等特點，是一種具有良好應用前景的減Cd措施，已成為當下研究的熱點[10]。其中，葉面噴施硒（Se）被認為是緩解作物中Cd 污染毒性效應的有效農(nóng)藝措施[11]。Se 能夠通過與Cd 形成復合物、促進Cd 的螯合作用以及區(qū)室化分布等方式，減少植物對Cd 的吸收和轉運[12]。研究發(fā)現(xiàn)，施Se 可以改變Cd 在植物亞細胞組分中的分布，通過增加Cd 在小白菜和水稻幼苗可溶性組分中的分布比例來降低Cd 的流動性[13-14]。然而龐曉辰等[15]發(fā)現(xiàn)施Se 增加了Cd 在水稻K優(yōu)818細胞壁中的分布，通過細胞壁對Cd的固定作用減少Cd 向地上部轉移。由此可見，Se對Cd 的阻控機制受作物類型和品種差異的影響。

紫色小麥與傳統(tǒng)小麥相比，具有對重金屬低積累的特性[16]。本課題組在前期大田試驗研究中發(fā)現(xiàn)，紫色小麥比傳統(tǒng)普通小麥有更低的Cd積累能力，但其籽粒中Cd含量仍未達到《食品安全國家標準 食品中污染物限量》（GB 2762—2017）對Cd的要求。因此，本研究擬對紫色小麥葉面噴施亞硒酸鈉（Na2SeO3），通過分析不同器官中Cd富集、轉運和亞細胞分布特征，探討施Se 對紫色小麥籽粒Cd 積累的影響，以期為今后利用該技術減少紫色小麥Cd積累提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

大田試驗位于四川省成都市金堂縣某安全利用耕地。該試驗地土壤類型為中性紫色土，其耕層（0～20 cm）pH 為7.42，有機質含量為12.44 g·kg-1，堿解氮、有效磷、速效鉀的含量分別為97.23、17.56、95.83 mg·kg-1，Cd 含量為0.35 mg·kg-1。供試的4 份小麥材料分別為蜀紫麥1702、蜀紫麥1705、蜀紫麥1706和紫糯麥168。采用Gao 等[17]的方法進行Na2SeO3溶液的配制：將2 767 mg的Na2SeO3固體溶解于1 L去離子水中，得到16 mmol·L-1的Na2SeO3溶液。使用前將Na2SeO3溶液分別稀釋到0.2、0.4、0.8 mmol·L-1（分別記作Se1、Se2、Se3），噴施等量去離子水作為空白對照（CK）。

1.2 試驗設計

小麥于2020 年10 月29 日播種，播種方式為撒播，播種量為150 kg·hm-2。4 種小麥均設置CK、Se1、Se2、Se3 4個處理，小區(qū)面積2 m×2 m，隨機區(qū)組設計，每個處理重復3 次，共48 個試驗小區(qū)，在小區(qū)周圍設置1 m 的緩沖區(qū)。在小麥孕穗期至灌漿期每間隔7 d進行1 次葉面噴施，每個小區(qū)每次的噴施量為1.5 L，共噴施3 次（4 月1 日、8 日、15 日）。于第3 次噴施后第14 天（4 月29 日）采集植物鮮樣測定根、葉亞細胞中的Cd 含量，小麥成熟后（5 月16 日）采集樣品分別測定根、莖、葉、籽粒中的Cd含量。

1.3 樣品采集與處理

試驗小區(qū)所在田塊地形起伏小、土壤理化特征均勻。于小麥播種前采用梅花法設置7 個混樣點，采集1 份耕層混合土樣用于土壤Cd 含量及其他基礎理化性質分析。為進行小麥各器官中亞細胞組分Cd含量分析，于第3 次葉面噴施后第14 天（4 月29 日），分別在每個處理小區(qū)距離邊界0.3 m 的區(qū)域內，按五點取樣法采集5株生長狀況良好的小麥混合成1份小麥鮮樣，共采集48 份。鮮樣用去離子水洗凈后將根、葉分別研磨，根據(jù)Jiang 等[18]的方法通過差速離心分離得到亞細胞內細胞壁、細胞器、可溶性組分，之后測定各組分中的Cd 含量。具體操作：樣品采集洗凈后擦干表面水分，收集到離心管并放入液氮中帶回實驗室，然后快速轉移到-80 ℃冰箱保存；稱取新鮮根系、葉片各0.2 g，然后加入組成為250 mmol·L-1蔗糖、50 mmol·L-1Tris-HCl（pH=7.5）與1 mmol·L-1二硫赤鮮糖醇（Dithioerythritol，DTE）的預冷提取液，充分研磨成勻漿液，將勻漿液轉移至離心管中在4 000 r·min-1條件下離心15 min，沉淀即為細胞壁組分，再將上清液在10 000 r·min-1條件下離心40 min，沉淀為細胞器組分，上清液為可溶性組分，試驗操作均在4 ℃下進行；細胞壁和細胞器組分經(jīng)10 mL 混酸（VHNO3∶VHClO4=4∶1）消解后，稀釋至25 mL，可溶性組分直接稀釋至25 mL，采用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀（Varian 720ES ICPOES，檢出限為1 μg·L-1）測定稀釋液中的Cd含量。

為進行成熟期小麥各器官Cd 含量分析，于小麥成熟后（5 月16 日），以相同的方法采集48 份小麥混合樣品，用去離子水洗凈后分為根、莖、葉和籽粒4個部分，在烘箱中105 ℃殺青30 min后，70 ℃烘干至質量恒定。將小麥各器官的樣品經(jīng)粉碎機粉碎，然后分別稱取各樣品0.3 g于錐形瓶中，加入10 mL混酸（VHNO3∶VHClO4=4∶1）消解，稀釋至25 mL后測定Cd含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用生物富集系數(shù)（Bioconcentration Factor，BCF）和轉運系數(shù)（Translocation Factor，TF）來評價重金屬在小麥各部位中的積累轉運能力[19]。BCF 為小麥各器官Cd 含量（mg·kg-1）與土壤中Cd 含量（mg·kg-1）的比值；TFA-B為B 器官Cd 含量（mg·kg-1）與A 器官Cd 含量（mg·kg-1）的比值；小麥A 器官Cd 的分配比例為A 器官Cd 含量（mg·kg-1）與根、莖、葉、籽粒Cd 含量總和（mg·kg-1）的比值。

數(shù)據(jù)采用Excel 2019 進行處理并制作表格。利用SPSS Statistics 20.0 軟件進行單因素方差分析（One-way ANOVA），用Duncan 法進行處理間多重比較（P＜0.05），使用Origin 2021制圖。根據(jù)假設的因果關系，使用Rstudio 2021，應用結構方程模型（SEM）來探究Se 濃度和小麥各器官Cd 含量對籽粒Cd 含量的直接和間接影響，使用PowerPoint 2019制圖。

2 結果與分析

2.1 葉面噴施Se對小麥各器官Cd含量的影響

4 種小麥根、莖、葉、籽粒中的Cd 含量隨Na2SeO3噴施濃度升高呈下降趨勢（圖1）。Se3處理時，4種小麥的籽粒Cd 含量下降最明顯，降幅為47%～63%，其中紫糯麥168 降幅最大。根、莖、葉中Cd 含量也呈現(xiàn)顯著下降趨勢，降幅范圍分別為25%～39%、27%～42%和18%～33%。

圖1 葉面施Se對小麥各器官Cd含量的影響Figure 1 Effects of foliar Se application on Cd content in wheat organs

2.2 噴施Se對小麥Cd富集及轉運的影響

在小麥各器官中Cd分布較高的器官為根和葉，占比分別為28%～36%和27%～38%，其次為莖，占比為21%～25%，籽粒對Cd 的積累能力最弱，僅占比10%～16%（圖2）。噴施Se 后，籽粒中Cd 分布占比下降1～7個百分點，其中紫糯麥168 下降最多。從作用顯著性和降幅來看，噴施Se對紫糯麥168籽粒Cd含量及分布比例的降低效果最好。

圖2 葉面施Se對小麥各器官Cd分布比例的影響Figure 2 Effects of foliar Se application on Cd distribution proportion in wheat organs

葉面噴施Se 后，4 種小麥各器官Cd 富集系數(shù)均顯著降低（P＜0.05），且隨著Na2SeO3濃度升高降幅增大（表1）。其中籽粒富集系數(shù)的減小程度最大，Se3處理時，4種小麥籽粒Cd富集系數(shù)降低45%～75%。

小麥Cd轉運系數(shù)表現(xiàn)為TF（莖-葉）＞TF（根-莖）＞TF（莖-籽粒）＞TF（葉-籽粒）（表2）。葉面噴施Se 后，TF（莖-籽粒）和TF（葉-籽粒）顯著減小（P＜0.05），且隨Na2SeO3濃度升高，下降程度逐漸增大，Se3處理時，降幅分別為22%～46%和34%～61%，其中紫糯麥168 降幅最大。TF（莖-葉）和TF（根-莖）整體變化不顯著。

表2 葉面施Se對小麥Cd轉運系數(shù)的影響Table 2 Effects of foliar Se application on Cd translocation factor in wheat

2.3 葉面噴施Se對小麥根和葉亞細胞中Cd分布的影響

2.3.1 根亞細胞Cd分布

4 種紫色小麥根亞細胞Cd 含量順序為可溶性組分＞細胞壁＞細胞器，根亞細胞各組分中Cd 含量隨Na2SeO3噴施濃度的升高呈下降趨勢（表3）。其中，Se3 處理與CK 相比，4 種小麥的Cd 含量在細胞壁中降低47%～67%，在細胞器中降低57%～72%，在可溶性組分中降低26%～52%。就Cd 的分配比例來看，小麥根部的Cd 主要積累于可溶性組分中，占小麥根部Cd 總量的53%～73%，其次于細胞壁中，占比為18%～33%（圖3）。Se1、Se2 處理后，4 種小麥根亞細胞各組分Cd 分布占比變化較小，隨著Na2SeO3濃度的進一步提升（Se3 處理），細胞壁的Cd 分布占比較CK 下降了3～12 個百分點，細胞器的Cd 分布占比下降了4～7 個百分點，而可溶性組分的Cd 分布占比上升了8～16 個百分點。

圖3 葉面施Se對小麥根亞細胞中Cd分布比例的影響Figure 3 Effects of foliar Se application on proportion of subcellular distribution of Cd in the roots of wheat

表3 葉面施Se對小麥根亞細胞中Cd含量（以鮮質量計）的影響Table 3 Effects of foliar Se application on subcellular distribution of Cd conten（tcalculated by fresh weight）in the roots of wheat單位：mg·kg-1

2.3.2 葉亞細胞Cd分布

由表4 可知，小麥葉部Cd 含量順序為可溶性組分＞細胞壁＞細胞器。葉亞細胞各組分中Cd 含量隨Na2SeO3噴施濃度的升高呈下降趨勢，與根亞細胞Cd含量變化情況相似。其中，Se3 處理與CK 相比，4 種小麥細胞壁中Cd 含量降低50%～53%，細胞器中降低75%～78%，可溶性組分中降低39%～46%。小麥葉片中的Cd 主要積累于可溶性組分中（圖4），占葉片Cd總量的59%～71%，其次為細胞壁，占比為21%～25%。隨著Na2SeO3噴施濃度的升高，蜀紫麥1702、蜀紫麥1705 和蜀紫麥1706 小麥葉亞細胞可溶性組分中的Cd 分布占比上升了6～10 個百分點，細胞器中下降了5～10 個百分點，而細胞壁中分布占比變化不明顯；紫糯麥168 在Na2SeO3噴施濃度最高時才出現(xiàn)明顯變化，可溶性組分中Cd 分布占比上升6 個百分點，細胞器中下降5個百分點，細胞壁中下降1個百分點。

表4 葉面施Se對小麥葉亞細胞中Cd含量（以鮮質量計）的影響Table 4 Effects of foliar Se application on subcellular distribution of Cd concentration（calculated by fresh weight）in the leaves of wheat單位：mg·kg-1

3 討論

不同品種小麥對Cd的積累存在一定差異。肖昕等[20]對蘇徐2 號小麥的研究發(fā)現(xiàn)，成熟期小麥植株中不同器官Cd 含量順序為根＞葉片＞莖＞穎殼＞果實。本試驗在3.5 mg·kg-1Cd脅迫環(huán)境下，蜀紫麥1702、蜀紫麥1705和蜀紫麥1706根部Cd富集最多，其次是葉部，而紫糯麥168 葉部Cd 含量大于根部（圖1），這與任超等[21]在土壤Cd 為4 mg·kg-1水平下對小麥的研究結果相似。這可能是由于不同小麥品種存在基因型差異，從而導致品種間Cd 積累特征的不同[22]。Wu等[23]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)Na2SeO3溶液噴施后，小麥各個器官的Cd含量均顯著降低。Xia等[24]的盆栽和田間試驗結果同樣表明，葉面施Se 可顯著降低小麥灌漿期籽粒中Cd的含量。屈嬋娟等[25]的研究發(fā)現(xiàn)，施Se 可降低油菜根、莖、葉中Cd的含量。本研究結果與以上研究大致相同，Na2SeO3濃度在0.2～0.8 mmol·L-1時，小麥各器官Cd 的含量隨Na2SeO3濃度增加呈降低趨勢，其中籽粒Cd含量下降最高，達63%（圖1）。在對水稻的研究中發(fā)現(xiàn)，Se和Cd存在明顯的拮抗作用，二者可形成難溶性復合物，從而減少植物根部對Cd 的吸收[26]。卞威樂斯等[27]的研究發(fā)現(xiàn)，施Se 不僅可以降低植物對Cd 的吸收，還可以降低已吸收的Cd 的活性。此外，外源Se 可抑制Cd 脅迫下植物根部Cd 吸收基因的表達，從而減少對Cd 的吸收[28]。本研究中，噴施Se 后，各器官Cd 富集系數(shù)相應降低，表明Cd 在各器官中的積累能力受到抑制。籽粒Cd 含量與根（圖5a）、莖（圖5b）、葉（圖5c）Cd 含量存在正相關關系（P＜0.05），葉面噴施Se 減少了小麥根部對Cd 的吸收，從而減少了Cd 向地上部轉運，因此籽粒中Cd 的積累量相應降低。

圖5 籽粒與其他各器官Cd含量的相關性分析Figure 5 Relationships of Cd content between grain and other organs

本研究探討了4 種小麥不同器官間Cd 的轉運特征，經(jīng)Na2SeO3溶液噴施后，4 種小麥的TF（莖-籽粒）和TF（葉-籽粒）均顯著下降（P＜0.05），然而，蜀紫麥1702 在Se1 處理后TF（根-莖）比其他3 種小麥顯著降低（表2），這是該品種籽粒Cd含量大幅下降的原因。表明噴施Se 后各品種小麥轉運特征存在差異，從而導致各品種小麥籽粒中Cd含量降低程度不同。進一步分析發(fā)現(xiàn)，4 種小麥經(jīng)Se 處理后TF（莖-籽粒）和TF（葉-籽粒）下降分別達到22%～46%和34%～61%（表2），小麥籽粒Cd 含量與TF（莖-籽粒）（圖6c）和TF（葉-籽粒）（圖6d）存在顯著的正相關關系，表明葉面施Se 主要是通過抑制Cd 從莖到籽粒和葉到籽粒的運輸來降低籽粒Cd 的積累量。Jiang 等[29]在對水稻的研究中發(fā)現(xiàn)，葉面施Se 可減少Cd 由莖、葉向穗部的轉運，使糙米中Cd 含量降低了40.36%。葉面可通過氣孔和表皮親水小孔直接吸收養(yǎng)分[30]，葉面噴施可使更多的Se 元素進入小麥莖、葉組織。Na2SeO3與莖、葉組織中的Cd 相結合形成難溶的CdSeO3，改變細胞膜對Cd的通透性[31]，從而抑制Cd由莖、葉向籽粒轉運。

圖6 籽粒Cd含量與小麥Cd轉運系數(shù)的相關性分析Figure 6 Relationships between grain Cd content and Cd transport coefficient in wheat

基于Se 濃度和小麥各器官中Cd 含量之間的影響關系生成的結構方程模型圖（圖7），進一步表明了葉面施Se 通過莖、葉對籽粒Cd 含量產(chǎn)生影響的路徑。該模型解釋了小麥籽粒Cd 含量方差的12%。Se對小麥根、葉Cd 含量有顯著的、直接的負效應（P＜0.001），其中，對葉的影響強度最大，為-0.97；莖、葉Cd 含量對籽粒Cd 含量有顯著的、直接的正效應（P＜0.001），影響強度分別為0.40 和0.38。Gao 等[17]在對水稻的研究中也發(fā)現(xiàn)莖、葉中Cd 含量對籽粒Cd 含量有顯著影響。上述結果表明，葉面施Se 可通過影響小麥葉Cd 含量來影響籽粒Cd 含量，也可通過抑制根對Cd 的吸收，進而改變莖、葉Cd 含量，最終影響籽粒對Cd的積累。

圖7 葉面施Se對小麥Cd含量的影響路徑結構方程模型圖Figure 7 Structural equation model for the path of effects of foliar Se application on Cd content in wheat

Cd在亞細胞水平的分布特征能深入揭示Se對植物吸收和轉運Cd 的影響機制[32]。本研究發(fā)現(xiàn)Cd 在小麥根、葉亞細胞中均主要分布于可溶性組分，其次是細胞壁，細胞器內含量最低，葉面噴施Se 后，增加了Cd 在可溶性組分中的比例。然而，李虹穎等[33]的研究表明，早秈788 水稻根、莖、葉亞細胞中細胞壁組分Cd 含量最高，且隨施Se 濃度升高呈上升趨勢。由此可見，不同植物中Cd 的亞細胞分布模式以及Se 對其分布的影響存在明顯差異。相關研究表明，植物會對進入細胞內的Cd通過區(qū)室化積累于液泡或固定在細胞壁，或形成Cd 鹽沉淀以及通過螯合方式來減輕Cd脅迫對植物的傷害[34]。大部分Cd會與細胞中的植物螯合肽（PCs）形成穩(wěn)定的PC-Cd 螯合物，該螯合物轉運至液泡中，以減少Cd 在細胞間的流動。Se 能促進谷胱甘肽（GSH）系統(tǒng)對PCs 的合成以及相關酶的活性[35]，PCs的增多又直接影響到液泡對Cd的分隔容量（VSC）大小[36]，進而增強Cd 在液泡中的滯留作用[37]。本試驗中，噴施Se 后小麥根、葉亞細胞中的Cd更傾向積累于可溶性組分中。這與張雯等[14]對水稻的研究結果相似。說明本研究中Na2SeO3的施用促進了紫色小麥根、葉細胞中的Cd被區(qū)室化于液泡。Lux等[38]的研究發(fā)現(xiàn)，Cd 主要通過質外體在小麥根、莖、葉、籽粒間運輸。隨著Na2SeO3的濃度增大，Cd 在可溶性組分中的比例相應增大，大量Cd 被阻隔于液泡中，減少了其在質外體中的流動轉移，最終減少了Cd向地上部的轉運，尤其是減少了由莖向籽粒和葉向籽粒的轉運。這說明Cd 的區(qū)室化是減少Cd 向籽粒轉運的一個重要因素。

4 結論

葉面噴施Na2SeO3能顯著降低紫色小麥各器官Cd的含量和富集系數(shù)，同時提高Cd在小麥根系中的分布占比，降低在籽粒中的分布占比。紫色小麥根、葉亞細胞中Cd的分布特征相似，含量順序為可溶性組分＞細胞壁＞細胞器。葉面噴施Se能降低小麥亞細胞各組分的Cd 含量，并促進細胞中Cd 區(qū)室化分布于可溶性組分，有效阻控Cd從莖到籽粒和葉到籽粒的轉運，這是Se減少籽粒Cd積累量的主要原因之一。