玉米幼苗根系對Cr（Ⅲ）的吸收動力學特征及途徑探討

居靜，王欣，陳永林，盛海君，汪曉麗，趙海濤*

（1.農業農村部耕地質量監測與評價重點實驗室，揚州大學，江蘇 揚州 225127；2.句容市農業技術推廣中心，江蘇 鎮江 212499）

土壤重金屬污染涉及食品安全和人類健康，已成為全人類近年來共同關心和亟待解決的世界性重大環境問題。鉻（Cr）位于元素周期表第四周期第六副族，是硬度最大的金屬。Cr 由于其廣泛的工業應用，已成為地下水、土壤及沉積物中第二常見的重金屬污染物[1]，也是我國實行重點防控的五種主要重金屬污染物之一[2]。據統計我國嚴重Cr 污染的土壤已超過1 250 萬t[3]。在自然界中Cr 擁有不同的價態（-2～+6），其中三價[Cr（Ⅲ）]和六價[Cr（Ⅵ）]是最穩定和最常見的形態。因土壤對Cr（Ⅵ）吸附力較弱，其具有較高的生物活性，無論對動物還是植物都具有毒性；而Cr（Ⅲ）進入土壤后一般會以沉淀形式存在，或被土壤黏粒吸附，在土壤中溶解度小、移動性差，所以能穩定存在，是一種對人類和動物健康至關重要的微量元素[4]，卻不是植物必需營養元素[5]。前人對Cr（Ⅵ）的研究較多[6-7]，而對Cr（Ⅲ）研究甚少。低濃度的Cr（Ⅲ）能促進植株的生長[8]，但高濃度時對植物有劇毒[9-10]，會抑制植物發芽、根系生長、幼苗生長和發育，誘導葉片失綠等。因此，為了采取針對性的措施減輕土壤中Cr（Ⅲ）污染對植物生長發育造成的危害，有必要充分研究Cr（Ⅲ）對植物的影響。吸收是重金屬元素在植物體內富集的第一步驟，然而，目前關于植物吸收Cr（Ⅲ）的生理機制仍不清楚[1]。Skeffington等[11]認為，Cr（Ⅲ）只是在細胞壁的陽離子交換位點被簡單地被動吸收。Barros 等[12]發現植物對Cr（Ⅲ）的吸收是通過滲透進行的。Shahid 等[13]指出Cr（Ⅲ）的吸收是不消耗能量的，但張學洪等[14]認為Cr超富集植株李氏禾對Cr（Ⅲ）的吸收可能存在需要能量的主動吸收過程。因此，目前對Cr（Ⅲ）進入植物根細胞內的方式還存在爭議。根的細胞質膜是與重金屬接觸的第一個功能結構[15]，并在金屬吸收中發揮著至關重要的作用[16]。目前人們對金屬通過何種通道進入細胞質膜內部有了一定的認識。一般認為，植物對非必需有毒元素的吸收是通過必需元素的吸收途徑進行的。Lindberg 等[17]對Cd2+進入小麥細胞質膜的機制進行研究后發現，Cd2+的吸收受到加入的氯化鈣和氯化鉀的抑制，也受到鈣離子通道抑制劑和鉀離子通道抑制劑的抑制，說明Cd2+通過Ca2+和K+的通道被吸收。Ivashikina 等[18]利用從擬南芥根分離出的原生質體對重金屬陽離子是否影響向內鉀通道的活性和電流及電壓等進行研究，發現重金屬陽離子可以阻止向內鉀電流的20%～70%，其阻止能力排序為：Cu2+＞Zn2+＞Sr2+＞Cd2+，由此推測，以上這些重金屬離子至少是部分通過K+通道進行吸收的。唐曉勇等[19]驗證了Fe 元素對Cr 元素的熒光有增強效應，并發現該增強效應還與Fe、Cr 元素的相互作用有關。Bonet 等[20]研究發現，Fe 的營養狀況可影響Cr 在植物根和地上部分的積累。Ramana等[21]認為Cr（Ⅲ）和Fe（Ⅲ）競爭根細胞膜上的吸收位點，從而使兩種離子的吸收存在拮抗效應。Liu 等[22]在Cr 超富集植物李氏禾上觀察到，Cr（Ⅲ）對Fe（Ⅲ）的吸收存在抑制作用。因此，對Cr（Ⅲ）進入細胞質膜的途徑需要進一步論證。

鑒于此，本研究通過水培實驗，探究不同Cr（Ⅲ）濃度對玉米幼苗Cr（Ⅲ）吸收的影響，以及ATP 酶抑制劑、Ca2+通道和K+通道抑制劑、Fe（Ⅲ）是否抑制玉米幼苗根系對Cr（Ⅲ）的吸收，旨在探討玉米幼苗根系對Cr（Ⅲ）的吸收動力學特征及途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與培養

試驗在揚州大學環境科學與工程學院養苗室進行，供試材料為玉米蘇玉20。玉米種子經浸泡、催芽、發芽、生長至一葉一心時，移栽至50% Hoagland營養液中培養7 d，保持間隙通氣20 min·h-1，每3 d更新一次營養液。營養液組成：Ca（NO3）2·4H2O 2.0 mmol·L-1、KNO30.5 mmol·L-1、KH2PO40.5 mmol·L-1、MgSO4·7H2O 1.0 mmol·L-1、H3BO34.6×10-2mmol·L-1、CuSO4·5H2O 3.0×10-4mmol·L-1、MnSO4·4H2O 9.1×10-3mmol · L-1、ZnSO4· 7H2O 7.7 × 10-4mmol · L-1、（NH4）6Mo7O24·4H2O 7.1×10-5mmol·L-1、EDTA-Fe 7.0×10-2mmol·L-1，用0.1 mol·L-1的NaOH 或0.1 mol·L-1的HCl調節pH至5.5左右。

1.2 試驗設計與測定內容

1.2.1 玉米幼苗對Cr（Ⅲ）的吸收

將在50% Hoagland 營養液培養7 d 后的玉米幼苗移栽到水培容器中，水培容器為直徑20 cm、高48 cm 的塑料圓桶，桶上有帶7 個孔的同質塑料圓蓋，根據文獻[14，22]及前期試驗結果[23]，本研究對玉米幼苗進行5 個濃度水平的Cr（Ⅲ）處理：0、2、5、10、20 mg·L-1（以Cr 計），Cr（Ⅲ）以CrCl3形式添加，每處理7 株，重復3 次，每3 d 換一次營養液，營養液pH 值調節為5.0～5.5。處理10 d 后取出玉米幼苗，用10 mmol·L-1EDTA 浸洗3 次，以去除玉米根系表面吸附的Cr 離子，再將植株分為根系和地上部分，并對各部分的鮮質量進行稱量，采用原子吸收分光光度法測定玉米根系和地上部鮮樣中Cr的含量。

1.2.2 ATP酶抑制劑對玉米幼苗根系Cr（Ⅲ）吸收的影響

將在50% Hoagland 營養液培養7 d 后的玉米幼苗移栽到裝有20%Hoagland 營養液的容器中預培養12 h，根據文獻[14，22]及前期試驗對玉米幼苗進行如下處理：①15.6 mg·L-1CrCl3（對照）；②15.6 mg·L-1CrCl3+25 μmol·L-1ATP 酶抑制劑（Na3VO4）；③15.6 mg L-1CrCl3+50 μmol·L-1ATP 酶抑制劑（Na3VO4）。24 h 后收獲玉米幼苗的根，用10 mmol·L-1EDTA 浸洗3 次，以去除玉米根系表面吸附的Cr 離子，采用原子吸收分光光度法測定根系Cr的含量。

1.2.3 離子通道抑制劑對玉米幼苗根系Cr（Ⅲ）吸收的影響

將在50% Hoagland 營養液培養7 d 后的玉米幼苗移栽到裝有20%Hoagland 營養液的容器中預培養12 h。根據文獻[14，22]及前期試驗對玉米幼苗進行如下處理：①15.6 mg·L-1CrCl3（對照）；②15.6 mg·L-1CrCl3+Ca2+通道抑制劑（1 mmol·L-1LaCl3）；③15.6 mg·L-1CrCl3+K+通道抑制劑（1 mmol·L-1C8H20CIN）。分別與4 h 和8 h 收獲玉米幼苗的根，用10 mmol·L-1EDTA 浸洗3 次，以去除玉米根系表面吸附的Cr 離子，采用原子吸收分光光度法測定根系Cr、Ca 的含量，采用火焰光度法測定K的含量。

1.2.4 Fe（Ⅲ）對玉米幼苗根系Cr（Ⅲ）吸收的影響

將在50% Hoagland 營養液培養7 d 的玉米幼苗分成3組放入不同營養液中進行處理：①完全缺Fe的20% Hoagland 營養液（-Fe）；②正常的20% Hoagland營養液（Normal）；③在正常的20%Hoagland營養液中加入15 mg·L-1的FeCl3（+Fe），預培養48 h 后，分別將0、10、20、40、80、160 mg·L-1的CrCl3加入這3 組處理中，4 h后收獲玉米幼苗的根，用10 mmol·L-1EDTA 浸洗3 次，以去除玉米幼苗根系表面吸附的Cr 離子，采用原子吸收分光光度法測定根系中Cr的含量。

1.3 數據分析與統計方法

本文數據為3 個獨立重復的平均值±標準差（STDEV）。采用Excel 2016 進行數據處理。用SPSS 23.0軟件進行方差分析，處理間的多重比較采用Duncan 法。玉米幼苗對Cr（Ⅲ）吸收的動力學曲線采用Origin Pro2021 軟件模擬Michaelis-Menten 方程f=Vmax×abs（x）/[Km+abs（x）]，abs（x）為底物濃度，Vmax為玉米幼苗對Cr（Ⅲ）的最大吸收速率，Km為米氏常數。

2 結果與分析

2.1 玉米幼苗對Cr（Ⅲ）吸收的動力學特征

玉米幼苗各部位對Cr（Ⅲ）吸收的動力學曲線見圖1。結果表明，玉米幼苗各部位對Cr的吸收動態均符合Michaelis-Menten 模擬曲線方程f=Vmax×abs（x）/[Km+abs（x）]特征。玉米幼苗各部位對Cr（Ⅲ）的吸收速率均隨著Cr（Ⅲ）處理濃度的增加而增加（圖1），對Cr（Ⅲ）吸收速率表現為：根系＞全株＞地上部。

圖1 玉米幼苗對Cr（Ⅲ）吸收的動力學曲線Figure 1 Kinetic curves of Cr（Ⅲ）uptake by maize seedlings

表1 為玉米幼苗對Cr（Ⅲ）吸收的動力學方程參數。Km表征離子載體與離子的親和力，Km值越大，親和力越小。結果表明，根系吸收Cr（Ⅲ）的Vmax為121.4 mg·kg-1·d-1，明顯高于地上部的16.3 mg·kg-1·d-1（P＜0.05），前者是后者的7.4倍；而根系吸收Cr（Ⅲ）的Km為12.2 mg·L-1，顯著（P＜0.05）低于地上部的180.8 mg·L-1，表明Cr（Ⅲ）與根系的親和力大于地上部。此結果說明，玉米幼苗吸收的Cr（Ⅲ）絕大部分累積在根系，只有很少的Cr（Ⅲ）被轉移到地上部。

表1 玉米幼苗對Cr（Ⅲ）吸收的動力學方程參數Table 1 Kinetic parameters of Cr（Ⅲ）uptake by maize seedlings

2.2 ATP酶抑制劑對玉米幼苗根系Cr（Ⅲ）吸收的影響

由圖2 可知，與對照相比，添加不同濃度的ATP酶抑制劑處理均顯著（P＜0.05）抑制了玉米幼苗根系對Cr 的吸收。25 μmol·L-1和50 μmol·L-1ATP 酶抑制劑處理后，玉米根系中Cr 的含量較對照分別降低了29.4%和50.6%。50 μmol·L-1ATP酶抑制劑的對玉米根系吸收Cr 的抑制作用大于25 μmol·L-1ATP 酶抑制。此結果說明，玉米幼苗根系對Cr（Ⅲ）的吸收存在主動吸收的過程。

圖2 不同ATP酶抑制劑添加濃度對玉米幼苗根系Cr吸收的影響Figure 2 Effects of ATPase inhibitor on uptake of Cr（Ⅲ）by maize seedling root

2.3 離子通道抑制劑對玉米幼苗根系Cr（Ⅲ）吸收的影響

由圖3 可知，4 h 和8 h 抑制處理下，Ca2+通道抑制劑（LaCl3）和K+通道抑制劑（C8H20CIN）均沒有顯著（P＞0.05）抑制玉米幼苗根系對Cr（Ⅲ）的吸收。Ca2+通道抑制劑顯著（P＜0.05）抑制了玉米幼苗根系對Ca2+的吸收，同樣K+通道抑制劑顯著（P＜0.05）抑制了玉米幼苗根系對K+的吸收（表2）。此結果表明，玉米幼苗根系對Cr（Ⅲ）的吸收與Ca2+、K+通道無關。

圖3 離子通道抑制劑對玉米幼苗根系Cr（Ⅲ）吸收的影響Figure 3 Effects of ion channel blockers on the uptake of Cr（Ⅲ）by maize seedling root

表2 離子通道抑制劑對玉米幼苗根系吸收Ca2+和K+的影響Table 2 Effects of ion channel blockers on the uptake of Ca2+and K+by maize seedling root

2.4 Fe（Ⅲ）對玉米幼苗根系吸收Cr（Ⅲ）的影響

圖4 結果表明，在-Fe、Normal、+Fe 各處理下，玉米幼苗根系對Cr（Ⅲ）的吸收速率均隨著Cr（Ⅲ）處理濃度的增加而增加，其吸收動態均符合Michaelis-Menten 方程。Cr（Ⅲ）處理濃度為40～160 mg·L-1時，與Normal 處理相比，-Fe 處理下Cr（Ⅲ）吸收速率增加了4.0%～26.3%，但+Fe 處理下Cr（Ⅲ）吸收速率降低了15.6%～33.7%。

圖4 不同Fe處理對玉米幼苗根系吸收Cr（Ⅲ）動力學曲線Figure 4 Kinetic curves of Cr（Ⅲ）uptake by maize seedling root under different Fe treatments

表3 結果表明，與Normal 處理相比，-Fe 處理下，玉米幼苗根系對Cr（Ⅲ）的Vmax增加了20.0%，Km數值僅減少了5%，-Fe 處理促進了玉米幼苗根系對Cr（Ⅲ）的吸收速率，略微增加了Cr（Ⅲ）與玉米幼苗根系吸收位點的親和力，而+Fe 處理下的玉米幼苗根系對Cr（Ⅲ）的Vmax減少了46.0%，Km數值減少了56.0%，-Fe 和+Fe處理下Vmax/Km數值基本不變。以上結果表明，Fe（Ⅲ）抑制了玉米幼苗根系對Cr（Ⅲ）的吸收速率，Fe（Ⅲ）與Cr（Ⅲ）之間存在反競爭性的抑制關系。

表3 不同Fe處理下玉米幼苗根系對Cr吸收的動力學方程參數Table 3 Michaelis-Menten equation constants of Cr uptake by maize seedling roots under different Fe treatments

3 討論

3.1 玉米幼苗對Cr（Ⅲ）吸收的動力學特征

目前，植株對Cr（Ⅲ）的吸收和分布機制仍未被完全了解[16]。Wu 等[24]研究了不同CrCl3處理濃度（0、2.5、5、10 mg·L-1）對白菜不同部位Cr 含量的影響，發現與白菜莖稈相比，根系Cr 含量增加了兩倍。另有研究將一些大型植物（水花生、空心蓮子草、疏螺旋體、鐵蓼和鳳眼蓮）暴露于25 mg·L-1和50 mg·L-1的CrCl3中，同樣觀察到根系中Cr 含量遠高于莖稈和葉片的現象，且在葉片中發現的Cr 含量幾乎可以忽略不計[25]。但張學洪等[14]研究發現，李氏禾中大約有一半的Cr 被轉移到地上部分，表明Cr 在李氏禾根部的移動性比較好，這可能與李氏禾是Cr 超富集植株有關。本研究發現，經不同濃度Cr（Ⅲ）（0、2、5、10、20 mg·L-1）處理10 d 后，玉米幼苗對Cr（Ⅲ）的吸收速率隨溶液中Cr（Ⅲ）濃度的變化趨勢符合Michaelis-Menten 方程，各部位對Cr（Ⅲ）的吸收速率均隨著Cr（Ⅲ）處理濃度的增加而增加，玉米幼苗根系對Cr（Ⅲ）的吸收速率顯著高于地上部（圖1），且Cr（Ⅲ）與根系的親和力顯著高于地上部（表1），表明玉米幼苗吸收的Cr（Ⅲ）絕大部分都分布在根系，從根系轉移到地上部的非常有限，這可能是因為非Cr 富集植物缺乏對Cr的轉運機制。

3.2 玉米幼苗根系對Cr（Ⅲ）的吸收途徑

本研究發現玉米幼苗吸收的Cr（Ⅲ）主要富集在根部，很少往地上部運輸，因此重點研究玉米幼苗根系對Cr（Ⅲ）的吸收途徑，但目前植物對Cr（Ⅲ）的吸收是主動吸收還是被動吸收，一直存在爭議。ATP酶包括P 型和V 型，其中P 型ATP 酶易被Na3VO3抑制，在植物體內廣泛存在[14]，本試驗中，在15.6 mg·L-1CrCl3處理下，不同濃度ATP 酶抑制劑均對玉米幼苗根系吸收Cr（Ⅲ）有明顯的抑制作用，表明玉米幼苗根系對Cr（Ⅲ）的吸收與能量有關，存在著主動吸收的過程，這與Skeffington 等[11]以大麥為研究對象開展的試驗結果相反，但與Liu 等[22]以李氏禾為研究對象開展的試驗結果一致。玉米植株對Cr（Ⅲ）主動吸收的方式讓其從土壤中吸收更多的Cr（Ⅲ），并在玉米根系中累積，產生毒害作用，從而影響玉米植株的生長發育。

由于Cr（Ⅲ）不是植物的必需營養元素，因此，植物對Cr（Ⅲ）的吸收可能是通過必需營養元素的途徑（如某些陽離子通道）進入細胞質膜[14]。前人研究發現，Ca2+和K+通道是細胞質膜上最重要的兩個離子通道[14，26]，可以分別被Ca2+通道抑制劑與K+通道抑制劑抑制。本研究發現，兩種抑制劑均沒有抑制玉米幼苗根系對Cr的吸收，但明顯抑制了玉米幼苗根系對Ca2+和K+的吸收，說明玉米幼苗根系對Cr（Ⅲ）的吸收不是通過Ca2+通道或者K+通道實現的。離子通道是細胞膜上的特殊蛋白質大分子，在脂質雙層膜上構成具有高度選擇性的親水孔道，從而允許適當大小和適當電荷的離子通過，其對通過的離子具有一定的選擇性。玉米對Cr（Ⅲ）的吸收沒有通過Ca2+和K+通道實現，表明其可能是通過其他的離子通道實現的。Cr（Ⅲ）和Fe（Ⅲ）有著相同的價態和相似的離子半徑（分別為64 ? 和69 ?）。Bonet 等[20]研究發現，Fe的營養狀況可影響Cr 在植物根和地上部分的積累；Pandey 等[27]研究發現Cr 脅迫下植株葉片的Fe 含量減少約50%。Liu 等[28]發現，在不同濃度Cr 處理中，Fe、Cu、Mg 和Zn 含量均有所下降。Park[29]發現，Cr（Ⅲ）處理降低了生菜對Fe 的吸收。本課題組前期研究發現，當Cr（Ⅲ）濃度＞5 mg·L-1時，玉米幼苗葉綠素含量隨著處理濃度的升高而降低，葉片表現出“失綠”癥狀[23]，且隨著Cr（Ⅲ）處理濃度的增加，玉米幼苗根系、葉片和全株的Fe 含量和累積量呈現下降的趨勢，這個結果說明Cr（Ⅲ）抑制了玉米幼苗對Fe 的吸收，推測玉米幼苗根系對Cr（Ⅲ）的吸收途徑可能與Fe（Ⅲ）有關。因此，本研究中采用-Fe 營養液、正常營養液、+Fe 營養液處理玉米植株，發現與正常營養液處理相比，-Fe處理下，玉米幼苗根系對Cr（Ⅲ）的Vmax增加了20.0%，Km數值僅減少了5%，-Fe 處理促進了玉米幼苗根系對Cr（Ⅲ）的吸收速率，略微增加了Cr（Ⅲ）與玉米幼苗根系吸收位點的親和力，而Fe（Ⅲ）處理下的玉米幼苗根系對Cr（Ⅲ）的Vmax減少了46.0%，Km數值減少了56.0%，這表明Fe（Ⅲ）抑制了玉米幼苗根系對Cr（Ⅲ）的吸收速率，兩者之間存在反競爭性的抑制關系（圖4、表3）。Fe（Ⅲ）究竟通過哪些關鍵因素影響了Cr（Ⅲ）的吸收速率尚不明確。因此，下一步的研究中，需明確Fe（Ⅲ）和Cr（Ⅲ）之間相互影響的深層次的生理機制，以期能為減輕Cr（Ⅲ）對植物危害的營養吸收的調節、對逆境環境的適應性等方面的改造提供科學參考。

4 結論

（1）玉米幼苗對Cr（Ⅲ）的吸收動態符合Michaelis-Menten 方程。根系對Cr（Ⅲ）的吸收速率顯著高于地上部，Cr（Ⅲ）與根系的親合力大于地上部。

（2）玉米幼苗根系對Cr（Ⅲ）的吸收存在主動吸收的過程。

（3）玉米幼苗根系對Cr（Ⅲ）的吸收與Ca2+和K+通道無關。

（4）Fe（Ⅲ）抑制了玉米幼苗根系對Cr（Ⅲ）的吸收，Fe（Ⅲ）與Cr（Ⅲ）之間存在反競爭性的抑制關系。