谷子TGA轉錄因子家族全基因組鑒定與分析

高 倩 ，秦迎迎 ，楊致榮

（1.山西農業大學 基礎部，山西 太谷 030801；2.山西農業大學 生命科學學院，山西 太谷 030801）

谷子（Setaria italica）起源于我國，是我國重要 的雜糧作物之一，在漫長的中國北方旱地農耕文明歷史中占有重要地位。谷子屬于1年生草本植物，是典型的二倍體禾本科作物（2n＝18），因其抗旱、耐貧瘠、適應性廣等特性，在當前的種植業結構調整中起著重要作用。谷子脫殼后稱為小米，是重要的健康保健食品，不僅營養價值豐富，而且可以改善慢性消化系統疾病[1-3]。最新研究也發現，小米群體代謝組與抗炎活性之間具有一定的關聯性，為小米作為藥食同源的食材和服務大健康產業提供了理論支撐[4]。

近年來，植物中越來越多的轉錄因子（Transcription factor，TF）被發現與研究。轉錄因子能夠與靶基因啟動子上的順式作用元件相互作用，激活或抑制下游靶基因表達，在植物生長發育以及脅迫響應過程中具有關鍵功能[2-3,5]。堿性亮氨酸拉鏈（Basic region/leucine zipper，bZIP）轉錄因子參與植物的生長發育、病原防御、高溫以及干旱脅迫應答等生物和非生物脅迫反應，根據其結構和功能被分為A、B、C、D、E、F、G、H、I和S共10個亞族[1,6]。TGA（TGACG motif-binding factor）轉錄因子屬于bZIP轉錄因子家族中的D亞族[6]，含有堿性區域（Basic region）和亮氨酸拉鏈（Leucine-zipper region）功能域[7]，能夠特異性地與TGACG激活序列（Activation sequence 1，as-1）結合來調控下游靶基因的表達，參與防御病害和生理生長2種不同進程[7-9]。TGA首先在煙草中被發現和克隆[10]，之后在 擬 南 芥[5,11]、玉 米[9]、水 稻[12]、大 豆[13]、大 麥[14]等 植物中被發現和研究。在擬南芥中，TGA家族基因有10個成員，分為Ⅰ～Ⅴ共5個亞組[5,11]，含有1～3個基因，其中亞組Ⅰ、亞組Ⅱ和亞組Ⅲ成員參與擬南芥響應水楊酸（Salicylic acid，SA）調控植株的抗病反應，亞組I、亞組Ⅱ和亞組Ⅴ成員參與花器官的發育過程，TGA8/PAN在擬南芥根尖靜止中心細胞中表達，與亞組Ⅱ的成員共同調控根的生長發育，在干細胞群動態平衡、細胞氧化還原動態平衡、植株抵抗病菌和光合作用中共同發揮作用[5]。在玉米葉的生長過程中，bZIP家族D亞族的Liguleless2基因能夠定位玉米葉片和葉鞘的邊界[9]。柯丹霞等[13]研究發現，在大豆中，GmTGA26可以調控下游的一系列脅迫響應基因，在很大程度上增強植株的耐鹽能力。連梓伊等[12]和李歡鵬等[14]研究發現，水稻和大麥中TGA轉錄因子與擬南芥類似，能夠響應SA調控的抗病反應，從而提高植株抗病性[15-18]。然而，目前在谷子中有關TGA家族基因成員及其功能的研究未見報道。

谷子具有基因組小（430 Mb）、自花授粉、生長周期短等特點，已經逐漸成為C4禾谷類模式植物[19]。本研究通過以谷子超早熟突變體xiaomi為研究對象，對谷子的TGA家族基因（SiTGAs）進行全基因組鑒定和初步預測分析，旨在為進一步研究谷子TGA轉錄因子的生物學功能提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 谷子TGA家族基因序列鑒定及其理化性質分析

在擬南芥數據庫TAIR（https://www.arabidopsis.org/）中搜索獲得擬南芥TGA的氨基酸序列，之后在谷子xiaomi數據庫MDSi:Multi-omics Database forSetaria italica（http://foxtail-millet.biocloud.net/home）中利用BlastP篩選xiaomi的TGA基因，篩選參數為score value≥100，e-value≤1×10-10，并利用Pfam（http://pfam.xfam.org/）對得到的氨基酸序列進行結構域驗證。最后利用EXPASY-ProtParam在線工具（https://web.expasy.org/protparam/）預測谷子TGA基因家族成員蛋白質一級結構的理化性質，包括氨基酸的數目、相對分子質量、等電點等，使用PSORT Prediction（http://psort1.hgc.jp/form.html）在線網站進行亞細胞定位，預測TGA家族蛋白質的表達位置。

1.2 谷子TGA家族基因的染色體定位

根據MDSi數據庫中xiaomi基因組文件（.gff格式）中的注釋信息，使用TBtools軟件提取谷子TGA家族基因在染色體上的位置信息，并對其進行可視化分析。

1.3 谷子TGA家族基因蛋白質的二級結構

將谷子TGA家族基因蛋白的氨基酸序列提交至SOPMA在線網站（http://www.prabi.fr/），分析其蛋白質二級結構。

1.4 谷子TGA家族基因的系統進化樹構建

使用Phytozome在線網站（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）和甘蔗基因組數據庫（http://sugarcane.zhangjisenlab.cn/sgd/html/downl oad.html），以TGA為關鍵詞，搜索并下載水稻、高粱和甘蔗TGA家族成員的氨基酸序列。使用MEGA 7.0軟件中的Align by ClustalW程序對谷子和擬南芥、水稻、高粱、甘蔗TGA基因家族成員的氨基酸序列進行多重比對，并采用鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）構建系統進化樹，Bootstrap參數設置為1000。

1.5 谷子TGA家族的基因結構分析

分析并整理xiaomi基因組信息（.gff格式），在Gene Structure Display Server（GSDS,http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）在線軟件中選擇.gff模式進行TGA家族基因結構圖的繪制。

1.6 谷子TGA家族基因保守基序及保守結構域分析

將谷子TGA家族基因成員的蛋白序列提交至MEME在線軟件（https://meme-suite.org/meme/tools/meme），預測其保守基序，輸出MAST MXL文件后，使用TBtools的MEME/MAST motif pattern redrawer功能進行可視化處理，繪制TGA家族基因Motif示意圖。使用NCBI-CDD數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）的Batch-CD-Search功能進行批量查詢，確定谷子TGA家族基因成員氨基酸序列的保守結構域，再利用TBtools軟件進行可視化分析。

1.7 谷子TGA家族基因啟動子分析

利用MDSi數據庫獲得谷子TGA家族基因的啟動子區域（ATG上游的2000 bp序列），將其提交至在線數據庫PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/），分析并確定谷子TGA家族基因啟動子區順式作用元件，使用TBtools軟件對其進行可視化分析。

1.8 谷子TGA家族基因表達分析

利用MDSi數據庫中獲取谷子TGA家族基因不同時期不同組織中的表達數據，將其提交至Heatmapper（http://www.heatmapper.ca/expression/）在線軟件中，分析并繪制TGA家族基因特異的組織表達熱圖。

2 結果與分析

2.1 谷子TGA家族基因成員的鑒定及其理化性質分析

通過同源比對，在谷子xiaomi中共鑒定到16個TGA家族基因成員，根據其在染色體上的排布，命名為SiTGA1～SiTGA16（圖1），對應的基因名稱及其理化性質如表1所示。SiTGAs在谷子的9條染色體上均有分布，SiTGA1、SiTGA14、SiTGA15、SiTGA16分別分布于1、7、8號和9號染色體上；SiTGA2-4、SiTGA9-11分別分布于2號和5號染色體上；SiTGA5-6、SiTGA7-8、SiTGA12-13則分別分布于3、4號和6號染色體上（圖1）。

圖1 谷子TGA基因家族成員染色體定位Fig.1 Chromosome localization of TGA gene family members in Setaria italica

對谷子TGA家族基因理化性質進行分析可知（表1），谷子TGA家族基因成員的基因序列長度為1906（SiTGA5）～8823 bp（SiTGA2），CDS序列長度996～1617 bp；蛋白質分子質量為36562.32～58030.21 u；蛋白質等電點范圍為6.18（SiTGA10）～9.25（SiTGA8），其中堿性蛋白8個，酸性蛋白8個。

從表2可以看出，谷子TGA基因家族蛋白二級結構中，α-螺旋為主要結構，占比為49.59%～68.88%；無規卷曲次之，占比為22.39%～41.98%；β-折疊和直鏈延伸占比較少，僅為1.45%～6.15%和4.45%～9.94%。對谷子TGA家族基因成員進行亞細胞定位預測可知（表1），SiTGA9定位在質膜表達，SiTGA13定位在內質網膜表達，其他的14個谷子TGA家族基因成員都定位于細胞核內，這與其主要作為轉錄因子發揮作用一致。

表1 谷子TGA基因家族的基本信息Tab.1 Basic information of TGA gene family in Setaria italica

表2 谷子TGA基因家族成員二級結構占比Tab.2 Proportion of secondary structure of TGA gene family members in Setaria italica %

2.2 谷子TGA家族基因成員系統進化及基因結構分析

為了研究谷子TGA家族基因的進化關系，對擬南芥的10個AtTGAs、水稻的15個OsbZIPs、高粱的22個TGA家族基因成員（Sobic.001G243800～Sobic.010G192432）、甘蔗的3個TGA家族基因成員（Sof008184、Sof001897、Sof009733）和 谷 子 的16個SiTGAs進行系統進化樹的構建，結果如圖2所示，谷子SiTGAs家族種間進化樹可分為6個亞組，分別是亞組Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ，其中SiTGA1、SiTGA2、SiTGA3、SiTGA8屬 于 第Ⅰ亞 組，與AtTGA10聚為一支，與第Ⅱ亞組的SiTGA6、SiTGA11、SiTGA13、SiTGA15聚為一支；SiTGA4、SiTGA5、SiTGA9、SiTGA10、SiTGA16隸屬于第Ⅳ亞組，其中SiTGA10與OsbZIP08聚為一支；亞組Ⅳ與亞組Ⅲ的SiTGA7聚為一支；亞組Ⅴ的SiTGA14和亞組Ⅵ的SiTGA12聚為一支。整體來看，谷子與高粱的親緣關系最近。

圖2 擬南芥、水稻、高粱、甘蔗和谷子中TGA基因家族的系統進化分析Fig.2 Phylogenetic analysis of TGA gene family in Arabidopsis thaliana，Oryza sativa，Sorghum bicolor，Saccharum officinarum，and Setaria italica

對谷子TGA家族基因成員的基因結構進行分析，結果顯示（圖3），全部基因呈現斷裂基因特征，均包含有外顯子和內含子；16個SiTGAs基因結構存 在 一 定 的 差 異，SiTGA1、SiTGA5、SiTGA9、SiTGA12、SiTGA13、SiTGA15基因結構中不含有5′和3′端非編碼區（UTR），其余的SiTGAs均含有非 編 碼 區，其 中SiTGA4、SiTGA6、SiTGA11、SiTGA14、SiTGA16含有2～3個5′端非編碼區（UTR），SiTGA8含有2個3′端非編碼區（UTR）。各基因的外顯子數目有7～12個不等，SiTGA11、SiTGA13、SiTGA15的外顯子數目較多，分別有12個，而SiTGA12的外顯子僅有7個。

圖3 谷子TGA家族基因成員基因結構Fig.3 Gene structure map of TGA gene family members in Setaria italica

2.3 谷子TGA家族基因成員保守基序及保守結構域分析

為了進一步了解谷子TGA家族基因成員的可能發揮的功能，對其保守基序和保守結構域進行了分析，結果發現（圖4），除SiTGA2不含有Motif 7基序，其余SiTGAs都含有Motif 1～Motif 7。Motif 8基序為亞組Ⅰ和亞族Ⅱ所特有；Motif 9和Motif 10基序為亞組Ⅳ所特有，說明Motif 8～Motif 10這3種基序在進化中分化程度很低，這可能是SiTGAs不同亞組在不同生理過程中發揮作用的重要原因。

圖4 谷子TGA家族基因成員保守基序（左）和保守結構域（右）分析Fig.4 Analysis of conserved motifs（left）and conserved domains（right）of TGA gene family members in Setaria italica

谷子TGA家族基因成員共包含4個保守結構域：DOG1、bZIP-HBP1b-like、bZIP superfamily和PHA03418 superfamily，每個SiTGAs都含有2～3個保守結構域。進一步分析發現，16個SiTGAs都含有DOG1結構域，DOG1結構域能夠高度特異性地控制種子休眠，推測谷子TGA家族基因成員能夠特異性地調控種子休眠。只有SiTGA1含有PHA03418 superfamily結構域，推測SiTGA1有不同于其余SiTGAs的功能。SiTGA7、SiTGA10、SiTGA13、SiTGA14、SiTGA15都含有bZIP_HBP 1b-like和DOG1保守結構域。SiTGA4、SiTGA5、SiTGA9、SiTGA16所含保守結構域的位置相似，推測它們具有相似的生物學功能。亞族Ⅰ成員除SiTGA1外其余3個都含有相同的保守結構域，亞族Ⅳ除SiTGA10外保守結構域的種類也相同，說明谷子TGA家族基因不同亞族間成員的保守結構域具有保守性。

2.4 谷子TGA家族基因成員啟動子序列分析

為了更深入地了解谷子SiTGAs的潛在功能，利用PlantCARE網站對SiTGAs的啟動子順式作用元件進行分析，共鑒定出17類順式作用元件，結果如圖5所示。

圖5 谷子TGA家族基因成員啟動子順式作用元件Fig.5 Cis-acting elements of TGA gene family member promoter in Setaria italica

從圖5可以看出，谷子TGA家族基因各成員具有順式作用元件類型的數量為4（SiTGA7）～11（SiTGA1）個。所有的谷子TGA家族基因成員都有光反應元件和赤霉素反應元件，推測SiTGAs基因的表達受到光誘導的調節，而且在赤霉素響應中也發揮著作用。大多數SiTGAs啟動子中含有水楊酸響應元件、ABA響應元件、干旱誘導元件，說明SiTGAs參與谷子的抗病性和抗逆性調控。除此之外，根特異的響應元件只存在于SiTGA1啟動子中，推測SiTGA1參與根分化過程的調控；生物鐘調控元件只存在于SiTGA2中，推測該基因可能參與晝夜節律的調控；SiTGA11、SiTGA13有細胞周期調控元件，這2個基因可能參與細胞周期的調控。

2.5 谷子TGA家族基因成員表達分析

為了探究SiTGAs在谷子生長發育過程中是如何發揮功能的，根據其在谷子不同組織以及發育不同時期的表達模式，繪制了基因表達熱圖如圖6所示，SiTGA7在花序中有較高的表達量；SiTGA3和SiTGA5表達模式比較類似，在萌發3 d的籽粒、未成熟小穗期和未成熟籽粒期表達量較高；除SiTGA3、SiTGA5、SiTGA7以外，其余的13個基因都在灌漿期根中有較高的表達。除此之外，SiTGA10在灌漿期穗頸節間和成熟后的籽粒中表達量較高，SiTGA15在萌發3 d的籽粒中表達量較高，SiTGA9、SiTGA2、SiTGA14、SiTGA1、SiTGA8、SiTGA4、SiTGA16在谷子灌漿期表達量較高。

圖6 谷子TGA家族基因組織表達模式Fig.6 Tissue expression pattern of TGA gene family in Setaria italica

3 結論與討論

本研究以谷子超早熟材料xiaomi為研究對象，通過與擬南芥中的TGA家族基因的同源比對，篩選得到了谷子的16個SiTGAs。通過系統進化分析發現，SiTGA1、SiTGA2、SiTGA3、SiTGA8和擬南芥的AtTGA10聚在Ⅰ亞組，這4個SiTGAs的保守基序和保守結構域總體較為相似，但是也有一些差異，其中SiTGA2中缺少Motif 7，SiTGA1缺少非編碼區且特有PHA03418 superfamily保守結構域。AtTGA10具有調控植株抗病和花器官發育的雙重作用[20-21]，而組織表達結果顯示，只有SiTGA3在未成熟的小穗和籽粒中表達量較高，其余3個SiTGAs在灌漿期尤其是灌漿期根中表達量較高，說明其功能與擬南芥中不完全相同，在谷子根的生長發育過程中發揮重要作用。

亞組Ⅱ成員SiTGA6、SiTGA11、SiTGA13和SiTGA15的保守基序種類相同，但SiTGA13、SiTGA15不含有非編碼區；SiTGA6和SiTGA11含有bZIP superfamily保守結構域，而SiTGA13和SiTGA15含有bZIP_HBP1b-like結構域。該亞組成員主要在灌漿期根部表達，推測其在谷子根發育中發揮重要作用。SiTGA15在萌發3 d的籽粒中表達也較高，說明其也參與調控籽粒萌發過程。同源基因OsbZIP79可影響萜類植保素積累從而調控水稻的抗病性[22]，推測該亞組成員參與谷子的抗病性。

SiTGA7和AtTGA8以及OsbZIP47聚為亞組Ⅲ的一支，PAN/AtTGA8是花器官發育的調節因子[23-24]，也是莖尖分生組織的控制中心，調控莖尖分生組織的大小以及花原基的數目等[25]，DE LUIS BALAGUER等[26]和HU等[11]研究還發現，PAN/AtTGA8在擬南芥根尖靜止中心細胞中表達，與AtTGA2、AtTGA5和AtTGA6共同調控根的生長發育，在干細胞群動態平衡、細胞氧化還原動態平衡、植株抵抗病菌以及光合作用中共同發揮功能，OsbZIP47在水稻籽粒的粒質量、粒寬的決定中發揮作用[22]。組織表達結果也顯示，SiTGA7在枝梗分化期的花序中表達量較高，因此推測，SiTGA7在谷子花器官發育，莖尖、芽尖分生組織調控以及根尖干細胞群維持中起著重要作用，是花器官發育過程中的調節因子，同時還在決定谷子籽粒的粒質量、粒寬的過程中發揮作用。

SiTGA4、SiTGA5、SiTGA9、SiTGA10、SiTGA16與擬南芥TGA家族成員AtTGA2、AtTGA5、AtTGA6、AtTGA9和水稻TGA家族成員OsbZIP03、OsbZIP08、OsbZIP28、OsbZIP63聚在Ⅳ亞組，其中SiTGA5和SiTGA9不含有非編碼區。SiTGA5比同一亞組中其他的SiTGAs缺少Motif 10，與同一亞組其他成員主要表達在灌漿期不同，SiTGA5主要表達于未成熟的小穗和籽粒。SiTGA9在灌漿期和未成熟的小穗和籽粒中均有較高表達，而在成熟后籽粒中表達極低。SiTGA10有bZIP_HBP1b-like保守結構域而不含有bZIP superfamily結構域，除在灌漿期根的表達量較高外在成熟后的籽粒中也有較高的表達。擬南芥AtTGA2、AtTGA5、AtTGA6不僅是水楊酸和茉莉酸/乙烯誘導的抗病反應所必需的，而且參與了UV-B脅迫的耐受反應，AtTGA9參與調控擬南芥抗病反應和花器官的發育過程[27-29]，水稻中OsbZIP08參與調控水稻的低溫抗逆[30]，OsbZIP03也在水稻耐鹽、耐旱、耐熱中發揮作用[22]，OsbZIP28在稻瘟病菌侵染應答中發揮重要作用[22]，因此推測亞組Ⅳ的谷子TGA家族成員主要參與調控谷子的抗逆反應。

SiTGA14和擬南芥TGA家族的AtTGA1、AtTGA3、AtTGA4、AtTGA7以及水稻的TGA家族基因成員OsbZIP37聚在第Ⅴ亞組，這4個擬南芥成員參與水楊酸調控的植株的抗病反應[15-18]，AtTGA1、AtTGA4和AtTGA7還參與了擬南芥花器官的發育過程[31-33]，OsbZIP37參與萜類植保素積累來抵御脅迫[22]，推測SiTGA14參與谷子中水楊酸調控的抗病反應和花器官的發育。第Ⅵ亞組的SiTGA12主要在灌漿期根中表達，推測其在谷子灌漿期根的生長發育過程中發揮功能。

通過對谷子TGA基因家族的表達模式進行分析，發現SiTGAs在種子萌發期、灌漿期、枝梗分化期以及小穗和籽粒發育時期都有表達，說明谷子TGA家族基因在谷子生長發育中發揮著重要的功能。除了SiTGA3、SiTGA5、SiTGA7以外其他13個基因都在灌漿期根部有很高的表達，說明SiTGAs在谷子根的生長發育過程中發揮重要作用。

本研究通過生物信息學方法對谷子TGA家族基因進行了全基因組鑒定，共鑒定出16個SiTGAs，對這些基因進行了生物信息學分析，結果顯示谷子TGA家族基因與高粱TGA家族基因的親緣關系最近，且親緣關系相近的SiTGAs其蛋白質理化性質、基因結構和結構域具有保守性。結合TGA家族基因成員的進化關系及SiTGAs在谷子中的表達模式結果可知，谷子TGA家族基因在調控谷子的抗逆反應，花器官發育，莖尖、芽尖分生組織調控以及根尖干細胞維持中起著重要作用。本研究結果為深入研究TGA轉錄因子在谷子生長發育和脅迫響應過程中的生物學功能提供了參考。