廣葉繡球菌多糖對鉛致小鼠骨骼鈣代謝紊亂的調節作用

喬澤寧，翟 晨，曹謹玲，云少君，程艷芬，程菲兒，馮翠萍

（山西農業大學 食品科學與工程學院，山西 太谷 030801）

鉛是一種環境中普遍存在的有毒重金屬，由于鉛在環境中不可降解且長期蓄積，其可通過水、空氣、土壤和食物鏈進入人體[1]。鉛進入機體后，約95%蓄積在骨骼之中，影響骨骼的新陳代謝和功能發揮，鉛中毒與骨骼發育畸形、骨質疏松、骨關節炎等多種疾病密切相關[2]。鉛可以取代機體內鈣、鋅、鐵二價礦物元素的位置，從而影響其他二價礦物元素的代謝，破壞其在機體內的平衡[3-4]。鉛可以作為鈣離子的類似物，直接影響鈣代謝并阻礙骨骼發育，還可以通過間接途徑影響骨代謝，主要表現為對一些與骨代謝有關激素的影響[5-7]。并且鉛在骨骼中的沉積還會對其形態結構、硬度、體積和厚度等產生影響，對骨骼造成損傷[8-9]。目前，對鉛中毒的治療主要是利用螯合劑，如乙二胺四乙酸鹽和二巰基琥珀酸等，但同時會帶來一系列的副作用[10]。

通過攝入天然食品組分，進而對鉛進行干預是預防慢性鉛損傷的發展趨勢。孟靜等[11]利用熒光定量PCR技術檢測了骨骼TRPV通路相關基因，發現適量鈣的補充可減輕鉛暴露對骨骼TRPV通路的干擾。李茜[12]研究表明，杏鮑菇多肽能夠顯著降低骨骼中鉛含量，調控TRPV通路相關基因的表達，從而改善染鉛導致的大鼠骨骼損傷。多糖是構成生命的四大基本物質之一，具有廣泛的生物學效應，還能直接影響機體的物質和能量代謝[13-14]。姬松茸多糖[15]、海藻多糖[16]等均有促進排鉛的作用，但是多糖對染鉛小鼠骨骼鈣代謝的影響還鮮少報道，并且多糖的促排鉛作用與骨骼鈣代謝之間的聯系還有待進一步研究。

廣葉繡球菌（Sparassis latifolia）是一種珍稀的食藥用菌，多糖含量可達39.3%～43.6%，為菇類之最[17-18]。研究表明，廣葉繡球菌多糖（Sparassis latifoliapolysaccharides，SLPs）具有免疫調節[19]、抑菌[20]、降血脂[21]、抗炎癥[22]和抗氧化[23]等作用。山西農業大學食品科學與工程學院食品營養與安全課題組前期對廣葉繡球菌多糖的結構進行了研究，結果表明，分離純化廣葉繡球菌多糖后，可以得到一種分子質量為6456 u、主鏈為β-（1→3）-D-葡聚糖、支 鏈 為β-（1→6）-D-葡聚糖的β-葡聚糖[24]。基于此，本試驗以染鉛小鼠模型為基礎，通過研究小鼠骨骼中二價礦物質元素的含量、鈣代謝相關激素和酶水平、骨組織形態以及鈣代謝相關基因表達情況的影響，進而探究SLPs對染鉛小鼠骨骼鈣代謝的影響。

1 材料和方法

1.1 試驗材料及動物

供試廣葉繡球菌由清徐縣太和食用菌栽培基地提供。

3周齡SPF級雄性昆明小鼠，購于斯貝福（北京）生物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2019-0010，飼養于山西農業大學試驗動物管理中心，許可證號：SYXK（晉）2020-0003。試驗飼料、墊料及動物飲水等均符合SPF級動物使用標準。

1.2 主要試劑及儀器

EDTA脫鈣液：EDTA-2Na 100 g加PBS緩沖液（pH值7.2）至1000 mL，加NaOH （10～15 g）攪拌溶解后用1 mol/L HCl調pH值為7.2～7.4。配置液經高溫殺菌后使用。

BGP、PHT、CT酶聯免疫吸附檢測試劑盒（上海江萊生物公司）；AKP試劑盒、總蛋白定量試劑盒（南京建成生物工程研究所）；蘇木精染液、伊紅染液（山西百奧生物科技有限公司）；切片石蠟（上海華申康復器材有限公司）；中性樹膠（北京索萊寶科技有限公司）；RNAiso Plus試劑盒、Prime ScriptTMRT Master Mix試 劑 盒、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒（TaKaRa公司）；引物合成（太原奧科鼎盛生物公司）；醋酸鉛、氯化鈉、檸檬酸鈉等均為國產分析純。

GD12 石墨消解儀（奧普樂儀器有限公司）；Optima5300 DV型電感耦合等離子發射光譜儀（美國PE公司）；切片機、展片機、攤片機（徠卡顯微系統（上海）貿易有限公司）；IX3顯微鏡（北京順能電子儀器有限公司）；-80 ℃冰箱（日本松下公司）；5417-R高速冷凍離心機、5804 R型高速低溫臺式離心機、核酸蛋白測定儀（德國Eppendorf股份公司）；Mx3000P熒光定量PCR儀（美國Stratagene公司）；SpectraMax i3x多功能酶標儀（美谷分子儀器（上海）有限公司）；MyCyclerTMThermal Cycler PCR擴增儀（美國Bio-Rad公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 SLPs的提取 根據山西農業大學食品科學與工程學院食品營養與安全課題組前期方法[25]提取廣葉繡球菌多糖，將廣葉繡球菌子實體置于35 ℃烘箱中干燥，切片粉碎并過0.074 mm篩，按照1∶40 （g/mL）的料液比添加蒸餾水，攪拌均勻，75 ℃水浴3 h后，5000 r/min離心15 min，旋蒸濃縮上清液至黏稠狀，加入3倍體積無水乙醇混勻后，4 ℃過夜，5000 r/min離心10 min收集沉淀，用丙酮和乙醚清洗沉淀直到洗液澄清，將沉淀用適量蒸餾水溶解后加入適量中性蛋白酶45 ℃水浴8 h并定時攪拌，滅酶后再次離心，取上清加入1/3體積Sevage溶劑（三氯甲烷∶正丁醇=4∶1），磁力攪拌30 min，離心取上層溶液并反復操作，用大孔樹脂純化后真空冷凍干燥后得到廣葉繡球菌多糖，苯酚硫酸法測定廣葉繡球菌多糖的純度為88.3%。

1.3.2 動物模型的建立和樣品采集 將70只3周齡的SPF級雄性昆明小鼠，在恒溫（（25±0.5）℃）、恒濕（50%±5%）的環境下適應性喂養7 d后，隨機分為5組：對照組（NC）、染鉛組（Pb）、低劑量多糖組（100 mg/kg·bw，L-SLPs）、中劑量多糖組（200 mg/kg·bw，M-SLPs）、高劑量多糖組（400 mg/kg·bw，H-SLPs），每組14只，均給予普通飼料，NC組給予去離子水，其余各組給予1.84 g/L醋酸鉛溶液。SLPs低、中、高劑量組小鼠每天灌胃一次，灌胃量根據小鼠當天的體質量計算，空白組和染鉛組每天灌胃等量生理鹽水。期間小鼠自由飲水攝食，記錄小鼠每天的體質量變化情況。飼養56 d后，采集骨骼組織稱質量。一部分右側股骨浸泡于4%多聚甲醛溶液中用作骨骼切片，其余在液氮中速凍后保存于-80 ℃冰箱待用。

1.3.3 SLPs對染鉛小鼠骨骼中二價礦物質元素含量的影響 參考GB 5009.12—2017標準[26]測定小鼠骨骼中二價礦質元素Pb2+、Ca2+、Fe2+、Cu2+、Zn2+、Mn2+、Mg2+的含量。取約0.2 g骨骼，稱質量后放于加有玻璃珠的消化管中，加入10 mL的濃硝酸和0.5 mL的高氯酸，室溫靜置過夜，于石墨消解儀上進行消化，待消化液澄清透明后用1%稀硝酸定容至10 mL即為待測樣品。使用電感耦合等離子發射光譜儀測定待測樣品中Pb2+、Ca2+、Fe2+、Cu2+、Zn2+、Mn2+、Mg2+的含量。

1.3.4 SLPs對染鉛小鼠骨代謝相關激素和酶含量的影響 按照甲狀旁腺激素（PTH）、骨鈣素（BGP）、降鈣素（CT）及堿性磷酸酶（AKP）試劑盒說明書測定。

1.3.5 SLPs對染鉛小鼠骨骼組織形態的影響 將小鼠股骨置于4%的多聚甲醛溶液中浸泡48 h后，用PBS緩沖液水洗5次，修整、去除多余肌肉組織后，將固定好的股骨置于EDTA脫鈣液中脫鈣，脫鈣液3 d一換，最少1個月，以大頭針可穿過時即可。將脫鈣后的股骨取出，自來水沖洗過夜后，經乙醇梯度脫水、二甲苯中透明、浸蠟和石蠟包埋后，固定于切片機切成厚度為4 μm的組織片（靠近脛骨端1/3處進行冠狀縱切）。攤片、烤片后進行HE染色，使用顯微鏡觀察骨骼組織結構的變化并拍照。

1.3.6 SLPs對染鉛小鼠骨骼鈣代謝相關基因表達量的影響 稱取100 mg骨骼組織，放到預先冷凍在-80 ℃的研缽中，立即加入液氮，加速研磨成粉末后轉移至1.5 mL EP管中，并加入1 mL RNAiso Plus，按照試劑盒說明書提取總RNA，使用核酸蛋白儀測定RNA濃度。按照Prime ScriptTMRT Master Mix說明書將RNA逆轉錄成cDNA。使用TB Green?Premix ExTaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）試劑盒在熒光定量PCR儀進行qRT-PCR，反應體系為：1 μL cDNA、5 μL TB Green?Premix ExTaqⅡ、上游引物與下游引物各0.4 μL、3.2 μL ddH2O。反應條件為：95 ℃ 90 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，95 ℃15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，95 ℃ 5 s和60 ℃ 30 s進行45個循環，每組重復3次。以β-actin為內參基因，通過2-ΔΔCt法計算各目的基因的相對表達量。具體引物信息如表1所示。

表1 實時熒光定量PCR引物序列Tab.1 Primer sequences of qRT-PCR

1.4 數據處理與分析

試驗所得數據使用SPSS 23.0進行統計學分析，采用one-way ANOVA和Duncan檢驗進行多組樣本間的差異顯著性分析，試驗結果以平均值±標準差表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著，利用 Graphpad prism 8.0.1軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 SLPs對染鉛小鼠體質量變化的影響

從圖1可以看出，在飼養56 d時間里，各組小鼠體質量均呈現增長趨勢。并且在同一時間內，各組小鼠之間體質量差異不顯著（P>0.05）。

圖1 SLPs對染鉛小鼠體質量變化的影響Fig.1 Effects of SLPs on weight in lead contaminated mice

2.2 SLPs對染鉛小鼠骨骼Pb2+、Ca2+、Fe2+、Cu2+、Zn2+、Mn2+、Mg2+含量的影響

SLPs對染鉛小鼠骨骼組織Pb2+、Ca2+、Fe2+、Cu2+、Zn2+、Mn2+、Mg2+含量的影響如圖2所示。

圖2 SLPs對染鉛小鼠骨骼組織Pb2+、Ca2+、Fe2+、Cu2+、Zn2+、Mn2+、Mg2+含量的影響Fig.2 Effects of SLPs on the contents of Pb2+，Ca2+，Fe2+，Cu2+，Zn2+，Mn2+，and Mg2+ in bones of lead contaminated mice

從圖2可以看出，與對照組相比，染鉛組骨骼組織中Pb2+含量升高了3948.78%，差異達極顯著（P<0.01），Ca2+、Fe2+、Cu2+、Mn2+含量分別降低了27.04%、43.00%、55.04%、72.34%，差異達極顯著（P<0.01），Mg2+、Zn2+含量下降，但差異不顯著。與染鉛組相比，高劑量SLPs組Pb2+含量降低了21.66%，差異顯著（P<0.05），Ca2+含量升高了26.65%，差異極顯著（P<0.01）；中劑量SLPs組Fe2+含量升高了40.74%，差異極顯著（P<0.01）；低、中、高劑量SLPs組在骨骼組織中Cu2+、Zn2+、Mg2+含量上升，但差異不顯著。

2.3 SLPs對染鉛小鼠鈣代謝相關激素含量和酶活性的影響

由圖3可知，與對照組相比，染鉛組骨骼中PTH含量升高了10.61%，差異極顯著（P<0.01），BGP、CT含量和AKP活性分別下降了12.42%、15.25%和26.03%，差異極顯著（P<0.01）；與染鉛組相比，各劑量SLPs組骨骼中PTH含量均有所下降，其中，高劑量SLPs組PTH含量降低了8.63%，差異顯著（P<0.05），低、中、高劑量SLPs組骨骼中BGP含量均有所上升，但差異不顯著，中、高劑量SLPs組骨骼中CT含量分別升高了7.73%和11.11%，差異極顯著（P<0.01），高劑量SLPs組AKP活性升高了25.54%，差異顯著（P<0.05）。

2.4 SLPs對染鉛小鼠骨骼組織形態的影響

SLPs對染鉛小鼠股骨組織形態的影響如圖4所示。

圖4 SLPs對染鉛小鼠股骨組織形態的影響（HE，×150）Fig.4 Effects of SLPs on the femur histomorphology in lead contaminated mice（HE，×150）

由圖4可知，對照組的股骨組織切片中的骨小梁正常，呈網狀結構，光滑飽滿、粗細一致，骨細胞分布均勻，清晰可見，可見正常的髓腔；染鉛組的骨小梁稀疏不均，分布紊亂，部分區域骨小梁出現中斷甚至消失，且骨小梁邊緣出現了陷窩。與染鉛組相比，高劑量SLPs組的骨小梁分布較均勻，骨小梁邊緣陷窩較少，可見部分正常的髓腔。

2.5 SLPs對染鉛小鼠骨骼中鈣代謝相關基因表達量的影響

從圖5可以看出，與對照組相比，染鉛組小鼠骨骼組織中TRPV5、TRPV6和NCX1mRNA表達量分別下降了90.81%、73.03%和44.68%，差異極顯著（P<0.01），PMCA1bmRNA表達量升高了157.75%，差異極顯著（P<0.01）。與染鉛組相比，高劑量SLPs組中TRPV5mRNA表達量升高了439.59%，差異極顯著（P<0.01）；高劑量SLPs組PMCA1bmRNA表達量下降了63.79%，差異極顯著(P<0.01)；中、高劑量SLPs組中TRPV6mRNA表達量分別升高了90.53%和116.06%，差異極顯著（P<0.01），各劑量SLPs組NCX1mRNA表達量均有上升，但差異不顯著（P>0.05）。

圖5 SLPs對染鉛小鼠骨骼中TRPV5、TRPV6、PMCA1b和NCX1 mRNA相對表達量的影響Fig.5 Effects of SLPs on the relative expression levels of TRPV5，TRPV6，PMCA1b and NCX1 mRNA in bones of lead contaminated mice

3 結論與討論

鉛是一種有毒重金屬，由于其不可降解，很容易通過食物鏈沉積在人和動物體內，從而對血液、腸道、免疫、骨骼等系統造成危害[27-29]。本試驗結果表明，與對照組相比，染鉛組小鼠骨骼中鉛含量極顯著升高，說明鉛暴露引起小鼠骨骼中鉛的蓄積，也證明了本試驗造模成功。同時鉛引起小鼠骨骼中鈣、鐵、銅、錳元素失衡，這可能是由于Pb2+與這些二價元素共用一個離子通道并存在競爭拮抗作用，且鉛與骨骼組織的親和性更強[4]。而染鉛小鼠在攝入SLPs后可有效調節骨骼中鉛、鈣、鐵含量，其機制可能是多糖以分子形式進入機體，提供氨基、硫酸基等官能團與鉛結合促進鉛的排出，同時SLPs與Ca2+、Fe2+等形成復合物從而抑制腸腔吸收，進而影響鈣、鐵的代謝，但其具體作用機制還有待探究[3,30]。

PTH是調節機體內鈣、磷平衡的重要激素之一，CT是PTH的拮抗物，可降低血鈣，促進骨細胞向成骨細胞轉化，降低破骨細胞活性和數量，從而促進骨骼的生長發育[31-32]。BGP和AKP均由成骨細胞合成，BGP會與Ca2+結合促進骨礦化，二者常用來評價成骨細胞生成骨質情況[33]。本研究發現，鉛可顯著降低小鼠骨骼中BGP、CT含量和AKP活性，顯著升高PTH含量，與李茜[12]的研究結果一致。AKP活性的降低可能是由于體內微量元素失衡引起的。鉛暴露導致的骨骼中BGP含量和AKP活性的降低，使成骨細胞凋亡增加，從而影響骨的礦化和成骨細胞正常功能的發揮，對骨骼造成了損傷，表現為骨小梁稀疏不均，分布紊亂，且骨小梁邊緣出現了陷窩。同時，機體鈣含量的降低促進了PTH的合成和分泌，以維持機體鈣平衡[34]。CT與PTH拮抗，CT含量降低，減緩生骨細胞向成骨細胞轉換的過程，破壞了機體正常骨形成和代謝。而高劑量SLPs可以有效逆轉這種趨勢，緩解鉛致骨骼系統功能的失衡，維持機體的骨代謝平衡，改善鉛致小鼠骨組織結構的損傷，使骨小梁分布更均勻，骨小梁邊緣陷窩較少。

TRPV5及TRPV6與鈣離子代謝有關，在腸道、腎臟、骨骼等器官中均有表達，NCX1和PMCA1b是細胞內鈣離子運出相關的通道[35-37]。本試驗結果表明，與對照組相比，染鉛組的TRPV5、TRPV6和NCX1mRNA表達量均極顯著下降，而PMCA1bmRNA表達量極顯著上升，以前的研究[11]支持本研究的結果。TRPV5和TRPV6mRNA表達量的下降，可能是由于TRPV5、TRPV6通路具有高度的鈣選擇性，當細胞外鈣離子濃度較低時，受到鈣依賴性反饋調節的作用，將鈣離子向細胞內轉運。同時，染鉛小鼠骨骼中鉛取代鈣主要以磷酸鉛的形式蓄積，為維持機體內骨鈣和血鈣平衡，骨骼組織中的鈣釋放進入血液，鈣的排出量增大，使PMCA1bmRNA表達量上升。而在PMCA1bmRNA表達量極顯著上升的同時NCX1mRNA表達下降，二者之間在轉運運出鈣過程中的具體機制還有待進一步研究。染鉛小鼠攝入SLPs后，上調了TRPV5及TRPV6mRNA的表達量，促進了機體對鈣離子的吸收，增加了骨骼的鈣含量，而骨鈣的增加減少了鈣向血液流動，PMCA1bmRNA表達量下調，使骨骼組織對鈣的運出減少。

綜上，SLPs可以促進機體對鉛的排泄，降低骨骼中鉛的含量，改善骨骼鈣鐵元素失衡，使骨骼中PTH水平降低、CT含量和AKP活性提高，同時會提高鈣離子向細胞內轉運通道TRPV5和TRPV6mRNA表達量，使細胞內吸收的鈣離子增加。鈣離子進入細胞后，鈣結合蛋白會與其立即結合，將鈣離子轉運至基底外側膜，并通過PMCA1b將鈣離子轉運出細胞外。SLPs降低了PMCA1bmRNA表達量，減少了鈣離子向細胞外轉運，從而提高了骨骼中鈣離子的含量，促進骨骼的生長發育，有效緩解了鉛致小鼠骨骼組織結構的損傷，調節小鼠骨骼鈣代謝紊亂。

本研究表明，鉛暴露導致小鼠骨骼中鉛蓄積，降低了Ca2+、Fe2+、Cu2+、Mn2+元素含量、BGP、CT含量和AKP活性，升高了AKP含量；小鼠骨骼組織結構損傷，骨小梁稀疏不均，分布紊亂，TRPV5、TRPV6和NCX1mRNA表達量下調，PMCA1bmRNA表達量上調。而SLPs可以逆轉這種趨勢，能夠促進機體對鉛的排泄，降低骨骼中Pb2+的含量，提高骨骼中Ca2+和Fe2+的含量，有效改善鉛致骨骼中鈣鐵元素失衡，降低骨骼中PTH水平，提高CT含量和AKP活性，從而促進骨骼的生長發育，有效緩解鉛對小鼠骨組織結構的損傷，促進TRPV5、TRPV6mRNA表 達，抑 制PMCA1bmRNA表達，調控鈣代謝相關基因，提示SLPs可有效緩解鉛致小鼠骨骼鈣代謝紊亂。