基于廉價碳源的微藻培養條件探究及優化

張家源 張紅兵 李海寧 郭帆

(1.河北經貿大學生物科學與工程學院，河北 石家莊 050061；2.華電水務科技股份有限公司，河北 石家莊 050061)

引言

微藻在自然界中通常是光能自養型的真核微生物，即通過光合作用將CO2轉化為自身的有機組成成分[1]；也可以進行異養培養，即在無光條件下通過呼吸或發酵途徑利用有機碳源；另外，還能進行混合營養培養，可同時利用CO2和有機碳，通過呼吸和光合作用生長，產生生物物質或代謝物。顯然光能自養培養方式更加經濟環保，異養培養擺脫了對光的依賴性需求，而混合培養兼具異養和自養的優勢，利用有機或無機物質(可以是廢棄物)的同時可以大幅提高微藻生物質的產量和質量。因此微藻的混合營養培養具有降低藻類生物質生產成本的可能性。

作為代表性的微藻，小球藻及其相關衍生產品在環境保護[2，3]、清潔能源[4-6]、醫療衛生[7]和營養食品[8，9]等行業具有重要的應用價值，一直是研究熱點。目前實驗室中多采用光能自養培養，生長相對緩慢，收獲量偏低，導致實驗周期長，成本居高不下，如果能夠通過合適的培養條件優化，就可以在縮短小球藻生長周期的同時提高產量，問題將迎刃而解。然而，以往研究多針對某種微藻進行條件優化[10，11]，所得到的結果普適性不足，培養成本較高，因此需要探索一種優異的、簡便廉價的培養方式。

本文以小球藻為例，使用廉價碳源糖蜜與蛋白胨，結合響應面法探究微藻混養模式條件，以取代原有光能自養模式，確定較好的培養條件，進一步探索該條件對于其他藻類生長的影響，為相關研究和生產提供參考。

1 實驗方法

1.1 培養方法

將小球藻(分離純化于華電水務科技股份有限公司，保藏于本實驗室)用BG11培養基(青島海博生物技術有限公司)活化后接種于各液體培養基中，初始接種量均為10%，在27℃、光照強度4000lx全光照培養，每日手搖4次，用光密度值(OD680nm)監控小球藻生長狀況。

1.2 單因素實驗

以BG11為基礎培養基進行自養培養；以糖蜜10g·L-1、蛋白胨5g·L-1、自然pH為基礎，加富培養基進行混養培養，單因素實驗選擇糖蜜為額外碳源，額外蛋白胨為氮源，培養至7d，觀察糖蜜、蛋白胨、光照強度3個基本變量因素水平強度與小球藻生長的關系，見表1。

表1 小球藻培養的單因素及其水平

1.3 響應面分析

以單因素實驗結果為基礎，使用Design-expert 8設計響應面實驗，考察的因素實際值與編碼值如表2所示，每組設3個平行實驗，取平均值進行響應面分析并確定優化培養基與培養條件。

表2 響應面分析考察的因素實際值與編碼值

1.4 常見培養基對小球藻生物量的影響

常見市售培養基(牛肉膏蛋白胨培養基、高氏1號液體培養基、馬鈴薯蔗糖液體培養基、LB肉湯培養基)以及1.3中得到的優化培養基，按1.1的方法培養小球藻，每隔24h的OD680數值繪制生長曲線。

1.5 優化培養基對不同藻種的影響

為對比不同微藻在優化的培養基中生長狀況，取對數期中后期的小球藻WS1001、小球藻WS1006、柵藻WS1008、柵藻WS1009(均由本實驗室分離純化保存)接種于BG11培養基與優化培養基，培養方法按1.1進行，吸光度測定并對比4株微藻自養、混養條件下的生長速率。

1.6 數據統計分析

每個實驗處理組均平行重復3次。本研究中實驗數據均采用SPSS 26.0軟件進行顯著性分析，差異顯著水平為P<0.05。

2 結果與討論

2.1 混養單因素對小球藻生長的影響

如圖1a所示，在混養情況下，糖蜜對小球藻生長速率具有顯著的促進作用(P<0.05)，在糖蜜添加量為10g·L-1、20g·L-1、30g·L-1時，與未加糖蜜相比，小球藻的生物量顯著增加(P<0.05)；如果糖蜜濃度繼續增加，微藻生長反而變慢，推測可能高濃度的糖蜜導致培養基中滲透壓升高，反而不利于小球藻的生長，與蘇杰龍等[12]研究一致。蛋白胨對微藻生長也有促進作用，且劑量效應很明顯，如圖2b所示；當蛋白胨濃度為5g·L-1時，與空白組相比較生物量顯著增加(P<0.05)，當濃度提高到15g·L-1效果最為明顯，當濃度高于15g·L-1以后效應逐漸變差，可能是過高的氮濃度反而抑制微藻的生長；Gutierrez等[13]也發現，在許多光自養型微生物中，高濃度的氮會破壞其光合作用系統，不僅導致其生長速率放緩，嚴重時可導致微生物死亡。至于光照強度，由于小球藻含有葉綠素，屬于具有光合作用的微生物，如圖1c所示，當沒有光照時，小球藻培養7d后的吸光度遠低于圖1a、圖1b中有光源時的數值，說明小球藻作為光自養微生物，光照是藻類生長的關鍵條件之一[14]，對藻類生物量的積累和生命活動影響巨大。即使碳源與氮源充足，缺乏光照仍然使小球藻的生長受到限制。圖1c結果表明，當光照強度提高到4000lx后，小球藻的生物量迅速提高，并在8000lx時達到峰值，說明8000lx左右的光照強度為最適光照強度。

圖1 糖蜜、蛋白胨和光照強度對小球藻生長的影響

2.2 響應面優化實驗

根據單因素實驗結果，使用Design expert 8中的Box-Behnken方法設計了17組實驗，結果如表3所示。

表3 響應面實驗設計及結果

使用Design expert 8對獲得的數據進行多元回歸擬合，所得到的回歸模型方程：

Y=6.45+0.081A+0.12B+0.34C-0.23AB-0.076AC

+0.19BC-0.17A2-0.36B2-0.27C2

由表4中回歸方差分析顯著性檢驗表明，校正系數R2=0.8460，RAdj=0.6480；并且該回歸模型顯著(P<0.05)，失擬項(P<0.2645)不顯著，說明模型合理且與實際實驗擬合度較高，并且模型預測值與實驗實測值具有較好的相關性，可以用于小球藻混和培養條件的分析和預測。

根據回歸方程和后續的方差分析可知，一次項C的差異顯著(P<0.01)，但B(P=0.2449)、A(P=0.4017)差異不顯著，各因素的顯著性排序為C>B>A。

為了分析各因素對于小球藻生長的影響，采用三維(3D)響應面和二維(2D)等高線圖表示回歸方程，觀察響應值與每個測試變量之間的關系，確定任意2個變量之間的相互作用，發現因變量的最大預測值位于三維響應面峰值或等值線圖中的最小橢圓上[15]。

表4 方差分析結果

圖2 培養條件交互作用對吸光度的影響

通過Design expert 8中的回歸模型預測得到，小球藻最佳培養條件為糖蜜17.40g·L-1，蛋白胨17.32g·L-1，光照強度11295.45lx；并考慮到實驗操作的可行性及減少相關能源的消耗，將回歸模型預測的理論值修整為糖蜜17g·L-1，蛋白胨17g·L-1，光照強度11000lx；在此培養條件下進行3次重復實驗，得到小球藻的生物量為6.32；與預測值6.60差異較小，表明響應面法生長條件優化結果是可靠的。

糖蜜和蛋白胨添加量的交互作用對吸光度的影響如圖2a、圖2b所示，AB交互曲面中吸光度隨著糖蜜的增加呈現先增加后降低的趨勢，其中當糖蜜添加量為20g·L-1、蛋白胨添加量為15g·L-1時，吸光度達到最大值6.3；等高線圖中糖蜜的等高線變化陡峭程度大于蛋白胨，結合方差分析，說明糖蜜對吸光度的影響大于蛋白胨。

圖2c、圖2d為光照強度和糖蜜的交互對于吸光度的影響，當糖蜜添加量為20g·L-1，光照強度為8000lx時，吸光度達到最大值7.33；等高線圖中光照強度的等高線較之糖蜜陡峭，同時結合方差分析，說明光照強度對吸光度的影響大于糖蜜。并且AC等高線圖呈橢圓形，說明糖蜜與光照強度的交互作用不明顯。

圖2e、圖2f為蛋白胨(B)和光照強度(C)的交互對吸光度的影響，在蛋白胨添加量為15g·L-1、光照強度為8000lx時，吸光度達到最大值6.3，結合方差分析，證明其相互間不具有顯著的交互作用。

2.3 不同培養基對小球藻生物量的影響

由圖3可知，LB肉湯和牛肉膏蛋白胨培養基雖然氮源均較豐富，但對應的生物量卻有顯著性差異，推測是NaCl濃度的差異導致，因為過高濃度的NaCl會抑制小球藻的生長，Li等[16]研究也證實，在BG11培養基中添加10～15g NaCl對綠藻的生長沒有顯著影響，而當NaCl濃度超過20g·L-1時有顯著抑制作用。

微藻在以蔗糖或淀粉為主要碳源時，其生長速率要遠低于以葡萄糖為主要碳源，甚至有些微藻完全不能利用蔗糖或淀粉，糖蜜中含有一部分葡萄糖可供微藻生長利用。本試驗中小球藻在高氏1號培養基中生長緩慢，培養至7d時的吸光度值僅為0.509，說明小球藻利用淀粉的能力非常有限；但在馬鈴薯蔗糖液體培養基中生物量有顯著提高，培養7d后的吸光度達到3.7左右。推測微藻的淀粉酶活性較弱，難以利用淀粉。

圖3 不同培養基對小球藻生物量的影響

2.4 優化微藻培養基對不同微藻的影響

4株不同微藻接種于優化培養基后的吸光度如圖4所示。結果表明，與BG11培養基比較，4株微藻在優化培養基及培養條件中生長速率、生物量均有顯著性提高。2株小球藻在接種后迅速進入對數期，柵藻的生長速率雖然在前3d時與自養條件相差不大，但生物量在4d后迅速增加，說明優化后培養條件可以不同的幅度明顯提升不同種微藻生長速率，對微藻的生長具有普適性。

圖4 優化微藻培養基對不同藻的影響

3 結論

本研究通過添加碳源與氮源，測定比較混合營養條件與光能自養條件下小球藻的生長速率與生物量；進一步使用響應面法優化混養培養條件的變化對小球藻生長的影響，最終培養條件優化為糖蜜17g·L-1、蛋白胨17g·L-1、光照強度11000lx；在此條件下小球藻吸光度值為6.32，與理論值差異可接受。綜合表明，優化后的混合營養條件可以顯著提高微藻的生長速率及生物量，節約育種時間，使用試劑廉價，操作簡便易行。