山羊痘病毒和綿羊痘病毒熒光PCR檢測方法的建立與應用

啜微微 耿慶華 趙永剛 孟祥勇 張敏 韓小虎 趙治國 付海濱

(1.沈陽海關技術中心，遼寧 沈陽 100016；2.中國動物衛生與流行病學中心，山東 青島 266033；3.沈陽農業大學，遼寧 沈陽 110866；4.呼和浩特海關技術中心，內蒙古 呼和浩特 010020)

山羊痘和綿羊痘是由痘病毒科的羊痘病毒屬(CaPV)[1]引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，癥狀為發熱、皮膚出現痘疹等。目前，小型反芻動物(綿羊和山羊)的CaPV感染分布廣泛，在非洲北部和中部、中東、歐洲和亞洲高度分布[2]，在世界較多國家和地區常有發生，造成巨大的畜牧經濟損失。我國農業部將其確定為一類動物傳染病，也是中華人民共和國進境動物檢疫疫病名錄一類動物傳染病。近年來，我國隨著各地羊養殖數量增加，流通交易頻繁，各地也有羊痘疫情的發生[3，4]。目前羊痘診斷主要依靠臨床癥狀進行判斷，采用疫苗免疫后，部分羊不出現明顯痘疹，但仍然帶毒排毒。因而臨床出現漏診及病毒污染范圍評估困難等情況。

近幾年，我國口岸進境活體山羊、冷凍羊肉及其制品逐年增多，按照海關總署國門生物安全監控方案，需要對這些商品檢測山羊痘和綿羊痘病毒。而目前現有國家標準和檢驗檢疫行業標準中均沒有山羊痘和綿羊痘的分子生物學檢測方法，農業部標準中也僅有PCR方法，暫時沒有熒光PCR方法。普通PCR方法，檢測時限較長，靈敏度較低，本研究選取山羊痘病毒P32基因序列保守區域作為檢測對象，建立了檢測山羊痘和綿羊痘病毒的熒光PCR檢測方法，為海關口岸實驗室羊痘病毒檢測標準的建立提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒及相關病毒核酸

山羊痘活疫苗、羊敗血性鏈球菌病滅活疫苗、山羊傳染性胸膜肺炎滅火疫苗和羊敗血性鏈球菌病滅活疫苗購自哈藥集團生物疫苗有限公司；口蹄疫O型/A型二價疫苗和小反芻獸疫活疫苗購自天康生物股份有限公司，布氏桿菌病活疫苗購自重慶澳龍生物制品有限公司，羊口瘡弱毒細胞凍干活疫苗購自青海省畜牧生物生物藥品制造廠。山羊痘P32基因陽性質粒由本實驗室構建并保留；山羊痘細胞滅活病毒、綿羊痘細胞滅活病毒，小反芻獸疫病毒核酸，藍舌病毒核酸，口蹄疫O型病毒核酸，口蹄疫亞洲1型病毒核酸，Q熱病毒核酸，山羊關節炎腦炎病毒核酸，羊口瘡病毒核酸，羊布氏桿菌病原核酸由中國動物衛生與流行病學中心國家外來動物疫病監測與研究中心饋贈。

1.1.2 儀器設備與試劑

QuantStudio5熒光PCR儀(Thermo公司)；EX3600全自動核酸提取儀(上海之江生物科技股份有限公司)；病毒核酸提取試劑盒，SuperReal PreMix(Probe)，RNase-Free ddH2O購自天根生化科技有限公司(TIANGEN)。引物、探針由上海生工生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 引物和探針設計與合成

參考GENEBANK(MT521862.1)山羊痘P32基因序列設計引物和探針序列。用RNase-Free ddH2O溶解至100μmol，-20℃保存。山羊痘P32基因通過全基因合成并連接于pUC57載體。引物P1和P2以及TaqMan探針P3用于建立山羊痘和綿羊痘的熒光PCR檢測方法。

表1 引物和探針序列

1.2.2 熒光PCR反應體系及反應條件的優化

提取山羊痘病毒和綿羊痘細胞滅活病毒核酸，初步使用的熒光PCR反應體系為25μL，其中2×real-time qTaq Mix 12.5μL，濃度為10μmol·L-1的P1、P2和TaqMan探針P3各1μL，DNA模板10pg，最后用去離子水補至25μL。熒光PCR的反應條件：在95℃變性2min；在95℃變性5s，分別選擇55℃和60℃退火/延伸30s的條件下進行45個循環，每次循環分別在55℃和60℃測定熒光值。熒光PCR反應的優化主要在退火/延伸溫度和時間2方面進行，其它條件不變。退火/延伸溫度在55℃和60℃2個溫度下進行優化；確定了退火/延伸溫度后再進一步對延伸時間進行優化，分別在40s、30s、20s和10s進行延伸。結果表明，所有的時間長度均可以獲得很好的檢測曲線。因此，該熒光PCR反應中的延伸時間確定為10s。

1.2.3 熒光PCR敏感性試驗

將山羊痘P32基因陽性質粒模板DNA用核酸測定儀測定濃度，進行10倍倍比稀釋為1.0×108～1.0×100copies·mL-1的濃度梯度，以這些不同濃度的質粒作為模板進行熒光PCR檢測，根據檢測結果確定該方法的敏感性。

1.2.4 熒光PCR特異性試驗

利用商品化的試劑盒提取健康羊的基因組DNA、滅活的綿羊痘病毒細胞培養物、山羊痘活疫苗、羊敗血性鏈球菌病滅活疫苗、山羊傳染性胸膜肺炎滅火疫苗、羊口瘡弱毒細胞凍干活疫苗、羊敗血性鏈球菌病滅活疫苗、口蹄疫O型/A型二價疫苗、小反芻獸疫活疫苗、布氏桿菌病活疫苗核酸，以及由中國動物衛生與流行病學中心國家外來動物疫病監測與研究中心饋贈的小反芻獸疫病毒核酸、藍舌病毒核酸、口蹄疫O型病毒核酸、羊口瘡病毒核酸、口蹄疫亞洲1型病毒核酸、Q熱病毒核酸、山羊關節炎腦炎病毒核酸和羊布氏桿菌病原核酸為模板分別進行熒光PCR檢測，根據檢測結果確定熒光PCR的特異性。

1.2.5 熒光PCR的重復性試驗

以1.0×108～1.0×101copies·mL-1羊痘P32基因質粒為模板進行熒光PCR分析，分別進行批內和批間重復試驗，根據實驗結果確定該方法的穩定性。所有的實驗結果均通過Origin統計學軟件進行分析。

1.2.6 模擬樣品的制備與檢測

實驗室將羊的相關傳染病的商品化疫苗、健康羊肉和羊血清按一定比例制成以下樣品：羊痘疫苗PBS懸液2份作為陽性對照(樣品編號為1～2)；經滅活的山羊痘病毒細胞培養物和健康羊肉制成的勻漿液分別按照1∶1、1∶2、1∶3的比例各1份(樣品編號為3～5)；經滅活的綿羊痘病毒細胞培養物和健康羊血清分別按照1∶1、1∶2、13的比例制成混合液各1份(樣品編號為6～8)；健康羊肉PBS懸液、小反芻獸疫活疫苗PBS懸液、口蹄疫O型/A型二價疫苗PBS懸液、山羊傳染性胸膜肺炎滅活疫苗PBS懸液、羊敗血性鏈球菌病滅活疫苗PBS懸液、布氏桿菌病活疫苗PBS懸液各1份(樣品編號為9～14)；共計14份樣品，提取模板核酸后，按照上述方法進行熒光PCR擴增，進行羊痘病毒的檢測。

2 結果

2.1 山羊痘和綿羊痘病毒熒光PCR探針和引物的設計

P32基因是山羊痘和綿羊痘病毒特異性基因，將該基因序列在GeneBank上進行Blast比對，P32基因序列具有高度保守性，在保守序列中設計引物和Taqman探針，如表1所示，靶序列片段大小為120bp。用設計的引物和探針對山羊痘和綿羊痘細胞滅活毒進行檢測，同時設置10個重復的陰性對照，結果如圖1所示，所有陰性對照在45個循環內均不起峰，而山羊痘和綿羊痘細胞滅活毒獲得很好的擴增效果，這些結果初步表明，該引物和探針能用于山羊痘和綿羊痘病毒的檢測。

注：A為山羊痘病毒；B為綿羊痘病毒。

2.2 熒光PCR反應條件的優化

在利用熒光PCR方法檢測病原過程中，退火和延伸溫度以及延伸時間是影響檢測方法好壞的關鍵因數，對這2個條件進行了優化。由于熒光PCR檢測方法中退火和延伸一般是在一個溫度條件下同時進行，因此在這個步驟中用商品化山羊痘疫苗核酸作為模板，優化了2個溫度，分別是55℃和60℃，結果如表2所示，在這2個溫度下進行退火/延伸的擴增結果沒有明顯區別，因此選擇60℃作為熒光PCR的退火/延伸溫度。確定了退火/延伸溫度后再進一步對延伸時間進行優化，分別在40s、30s、20s和10s進行延伸。結果如圖2所示，所有的時間長度均可以獲得很好的檢測曲線。因此，該熒光PCR反應中的延伸時間確定為10s。

表2 不同退火/延伸溫度下檢測的Ct值比較

圖2 不同延伸時間下熒光PCR檢測結果

2.3 熒光PCR檢測方法敏感性的確定

為了確定該熒光PCR方法檢測的敏感性，對其檢測限進行了確定。將p32基因的質粒從1×108copies·mL-1進行10倍系列稀釋至1×100copies·mL-1，然后對這些稀釋的標準陽性模板進行熒光PCR擴增，結果如圖3所示，檢測結果為1.0×108～1.0×103copies·mL-1濃度梯度的CT值分別為19.81、24.26、27.37、28.43、30.37、33.37、37.70，且均有典型的S型擴增曲線；1.0×102～1.0×101copies·mL-1濃度梯度的CT值分別為41.07和42.40，但2個擴增曲線不明顯；1×100copies·mL-1的質粒樣品檢測為陰性，因此該熒光PCR方法的檢測限為1000copies·mL-1。

2.4 熒光PCR檢測方法特異性的實驗

為了進一步確定建立的熒光PCR檢測方法的特異性，用該方法檢測1.6中提到包括羊的基因組、羊的多種常規傳染病的病毒和核酸。如圖4所示，在所有檢測結果中只有山羊痘和綿羊痘檢測出陽性，其它核酸檢測均為陰性。這些結果表明建立的熒光PCR檢測方法具有高度的特異性。

注：1～9依次為1×108～1×100copies·mL-1；10為陰性對照。

圖4 熒光PCR特異性檢測

2.5 熒光PCR重復性實驗結果

為了確定熒光PCR檢測方法的穩定性，以1×108～1×101copies·mL-1的標準質粒為模板進行重復性檢測，重復性檢測的Ct值分析結果如表3所示，結果表明，1×108～1×103copies·mL-1不同濃度標準質粒檢測的組間和組內Ct值均小于38，且擴增曲線明顯，變異系數均小于3%；而1×102～1×101copies·mL-1，Ct值均大于40，且擴增曲線不明顯。因此，該檢測方法具有良好的重復性。可以初步確定Ct值小于38且擴增曲線明顯，檢測結果判定陽性的，而當Ct值大于38小于45，且擴增曲線不明顯時判為疑似。

2.6 模擬樣品的檢測

實驗室將羊的相關傳染病的商品化疫苗、健康羊肉和羊血清按一定比例制成1.8中所述混合液樣品14份，提取核酸后，按照上述方法進行熒光PCR擴增，結果如圖5所示，2份羊痘疫苗PBS懸液，滅活的綿羊痘病毒細胞培養物和健康羊肉制成的勻漿液(1∶1、1∶2、1∶3)，滅活的綿羊痘病毒細胞培養物和健康羊血清混合液(1∶1、1∶2、1∶3)等8份樣品為陽性，其他6份樣品均為陰性，與預期結果相符合。

表3 熒光PCR組內和組間重復性試驗結果

注：1～2為1～2號樣品；3為3號樣品；4為6號樣品；5為4號樣品；6為7號樣品；7為5號樣品；8為8號樣品。

3 討論

CaPV的傳播主要通過直接接觸受污染的呼吸道飛沫或通過受污染的環境和載體間接接觸[5]。然而，這些病毒可以在環境中存活很長時間。因此，受污染動物活動是病原體傳播的最重要原因[6，7]。臨床上，受感染的羊出現發燒、皮損、結膜炎伴眼鼻分泌物、流涎過多、全身性皮膚丘疹或結節，這些丘疹或結節可能會擴散到呼吸系統和胃腸道系統[8]。

山羊痘和綿羊痘是小型反芻動物最重要的病毒性疾病，該病在各地的流行會造成綿羊和山羊嚴重的生產損失，其限制了國際貿易并造成其他的經濟損失[9，10]。因此，世界動物衛生組織(WAHO)將CaPV歸類為法定傳染病，因為其具有快速的跨界傳播，對畜牧業產生廣泛的經濟影響[11，12]。在全球范圍內，這種疾病對小型反芻動物生產和糧食安全造成嚴重威脅，并危及國際貿易[13]。據世界動物衛生組織報道，2010—2022年該病在包括保加利亞、中國臺北、以色列、哈薩克斯坦、吉爾吉斯斯坦、蒙古、摩洛哥、希臘和俄羅斯等國家或地區曾有發生，在希臘、以色列和俄羅斯等國家反復多次發生，呈地方性流行，給當地養殖業造成了很大的影響。2022年4月蒙古向世界動物衛生組織(WAHO)緊急報告發生綿羊痘和山羊痘疫情，涉及2747只綿羊，其中95只發病，死亡13只。

近幾年，國境口岸進境活體山羊、綿羊和冷凍羊肉及其制品逐年增多，給山羊痘和綿羊痘的傳入帶來很大風險。按照相關要求海關實驗室要對這些動物和產品依照標準方法檢測山羊痘和綿羊痘病毒。而目前現有國家標準、農業部標準和檢驗檢疫行業標準中均沒有山羊痘和綿羊痘的熒光PCR檢測方法。本研究即是為口岸動物檢疫實驗室檢測山羊痘病毒和綿羊痘病毒建立標準方法而開展，研究中選用P32基因作為目標檢測基因，因為綿羊痘病毒、山羊痘病毒的表面膜蛋白P32基因序列高度保守，在核苷酸水平上同源性為97.5%，在氨基酸水平上同源性為94.7%[14，15]。

本研究經過對熒光PCR反應的退火溫度、延伸時間的摸索，確定了檢測最佳反應條件，同時經過多次批內和批間的重復試驗，初步確定了檢測山羊痘和綿羊痘病毒熒光PCR檢測方法判定陽性的Ct值為小于38，而當Ct值大于38小于45時判為疑似。判為疑似的樣品，對于海關進境活體羊可以重新采樣再檢測，進境的羊肉制品可以擴大抽樣范圍再行檢測。

研究中多次采用商品化的山羊痘疫苗作為實驗室檢測過程中的陽性質控樣品，結果非常穩定準確。在動物檢疫實驗室，由于生物安全的要求，以往的實驗室在檢測過程中一般采用合成特異基因的質粒作為陽性質控樣品，但是以質粒作為陽性質控，如果濃度控制不好很容易引起氣溶膠污染；而且質粒只能作為PCR反應的過程中的陽性質控，不能作為核酸提取過程中的質控樣品。本研究采用商品化山羊痘疫苗作為檢測過程的陽性質控，與被檢樣品一起經過核酸提取、熒光PCR反應和檢測結果讀取等過程，可以作為整個檢測過程中的質控樣品。同時還可以用于海關等動物檢疫實驗室人員培訓和上崗中的考核樣品。為該方法的標準化及更好的在動物檢疫實驗室中應用提供了依據。