綠殼蛋雞群體的選育及蛋殼顏色分子標記的應用研究

吳震洋 宋興超 羅杰 廖恩俊 田旭 艾德錢 王云燕 李麗

(1.銅仁學院農林工程與規劃學院，貴州 銅仁 554300；2.甘肅農業大學食品科學學院，甘肅 蘭州 741000；3.銅仁職業技術學院，貴州 銅仁 554300)

長順綠殼蛋雞作為我國珍稀地方品種之一，具有覓食性強、耐粗飼，蛋殼厚且質密，蛋殼顏色呈現不同程度綠色等特點。長順綠殼蛋雞選育較晚，目前還未開展系統性的選育工作，開產日齡為165～195日齡，開產日齡相對較晚，且年產蛋量120～150個，年產蛋量很低。有關蛋殼顏色的研究開展于20世紀初，蛋殼顏色主要由3種色素所決定[1，2]。其中，綠殼蛋雞的綠殼性狀是膽綠素及其鋅螯合物在雞蛋形成過程中沉積在蛋殼中所致[3]。雖然蛋殼形成的部位在雞輸卵管的子宮部，但膽綠素的合成和分泌部位仍存在爭議。

Bruckner等最早發現綠殼基因和豆冠基因連鎖[4]，而Zartman則將豆冠基因定位到雞的1號染色體，說明綠殼基因位于雞的1號染色體[5]。隨后發現了和綠殼基因連鎖的許多基因、SNP位點或分子標記，進一步將綠殼基因在1號染色體的位置精細化。Wang[6]等通過對有機陰離子轉運體1C1基因(SLCO1C1)表達水平的分析，發現SLCO1C1基因影響綠殼蛋的形成。而Wang等[6]和Wragg等[7]最終闡明綠殼蛋形成的分子機制。

本試驗利用綠殼蛋雞蛋殼顏色性狀的分子標記對長順綠殼蛋雞進行了初步的選育，分別以長順綠殼蛋雞和羅曼粉蛋雞為父、母本進行雜交，觀察雜交F1代的體型、外貌特征及生長性能，為探討雜交F1代的可利用性及雜交模式提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗父本為長順綠殼蛋雞公雞，母本為羅曼粉白羽蛋雞，飼養場地為銅仁職業技術學院養殖場，飼養方式為籠養，并在雛雞脫溫后進行淘汰選留。選取30只180日齡攜帶綠殼基因且采精反應強的長順綠殼蛋雞公雞作為父本，210只173日齡處于產蛋期的羅曼粉白羽蛋雞作為母本進行雜交試驗。采用人工授精的方式進行配種，比例為1只公雞配種7只母雞，每只母雞隨機收集7～8枚種蛋共計1538枚種蛋進行孵化。日糧組成及營養水平見表1。

1.2 外貌觀測及綠殼性狀雛雞篩選

出雛當天，觀察F1代雛雞初生羽色，統計各類型羽色比例。F1代30日齡時，翅靜脈采血，提取DNA后利用分子標記對綠殼性狀基因檢測，對綠殼基因型進一步判別，篩選產綠殼雞蛋的雛雞，最終篩選出370只雛雞進行進一步飼養。綠殼基因純合型標注為LC/LC，綠殼基因雜合性標注為LC/N，非綠殼基因型標注為N/N。分子標記引物序列見表2。

表1 試驗雞日糧組成及各階段營養水平

表2 引物序列信息

1.3 生長性能指標測定

測定親代和F1代的試驗群體生長性能，測定方法依據《NY/T 823-2004家禽生產性能名詞術語和度量統計方法》。F1代分別在30日齡和60日齡時，各隨機選擇40只公雞和40只母雞進行生長性能指標測定。

1.4 統計與分析

用Excel軟件對數據進行整理，使用SPSS 21.0進行t檢驗分析差異顯著性，定義P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 雜交F1代與親代外觀比較

父本長順綠殼蛋雞公雞背羽、腹羽紅黑相間，頸羽、鞍羽赤紅，主翼羽、尾羽墨綠而有光澤；母本羅曼粉羽色均為純白色。雜交F1代共孵化出1276羽雛雞，677羽公雛，599羽母雛進行育雛，40日齡時觀察羽色。F1代總體分為白羽、紅麻羽和黑羽3種羽色，分別占64.03%、24.37%、11.60%。F1代麻羽分為2種羽色，一種是麻色深度與純度不及長順綠殼蛋雞公雞，另一種以紅褐色為主而無麻色羽毛或麻色較淺，與長順綠殼蛋雞差異較大。而白羽與羅曼粉蛋雞羽色一樣，黑羽為新分離出的毛色。整體而言，F1代羽色出現明顯分化，白羽個體為主，還出現了麻色和紅褐色的個體，少部分為黑色，與長順綠殼蛋雞總體相似的麻羽個體較少。

圖1 雜交一代羽色分布

2.2 雜交F1代的綠殼性狀篩選

經過對父代50羽長順綠殼蛋雞、40日齡F1代公雞677羽、母雞599羽共計1276羽進行基因型判斷，F1代公雞的綠殼基因型為82.3%，母雞的綠殼基因型為82.8%，選留產綠殼蛋母雞270羽留種，淘汰產粉殼蛋的個體。公雞的選育首先按照紅麻羽、黑羽和白羽的順序選留，共選取50羽進行留種。圖2為綠殼基因檢測電泳圖片，表3為雞群體中的基因型頻率。

注：Marker條帶為100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、1500bp、2000bp。

表3 長順綠殼蛋雞及F1代群體中的基因型頻率

2.3 雜交F1代的生長性能

雜交F1代1周齡、3周齡、5周齡、6周齡、7周齡、8周齡、9周齡、10周齡母雞平均體重分別為71.34g、167.21g、326.58g、357.01g、364.56g、410.50g、620.06g、645.93g，見圖2。雜交F1代日齡母雞體重呈上升趨勢，1～5周齡體重上升較快，6～8周齡趨于平緩，9周齡時體重有較大上升。商品代羅曼粉蛋雞體重則呈現穩步增長，和商品代羅曼粉蛋雞1～10周齡體重數據相比，F1代雛雞體重均比商品代羅曼粉蛋雞體重輕。

與親代相比，F1代母雞1周齡、3周齡、5周齡體重和同周齡羅曼粉母雞(P>0.05)差異不顯著，但6周齡、7周齡、8周齡、9周齡、10周齡體重均極顯著低于同周齡羅曼粉母雞(P<0.01)。

圖3 1～10周齡雛雞體重增長趨勢

3 討論

本試驗選用長順綠殼蛋雞為父本，羅曼粉蛋雞為母本進行雜交，目的將綠殼基因導入到雜交F1代中，通過綠殼基因分子標記對F1代進行篩選，使得F1代的綠殼率達到90%以上并測量其生長性能。后續再利用篩選出的F1代作為父本，不斷和羅曼粉蛋雞進行級進雜交，以期獲得高產的綠殼蛋雞，最后通過橫交固定進行純系的培育。而毛色的改良則在純系培育的基礎上，進行進一步的雜交改良，以期獲得較好的商品代雞種，提高市場的競爭力。

長順綠殼蛋雞與羅曼粉白羽蛋雞的雜交F1代以白羽為主，占比64.03%，其次為紅麻羽，占比24.37%，其余為黑羽。雞的某些羽色除了單基因或少數基因控制外，還存在基因互作效應，因此不同品種的雞進行雜交，會出現不同程度的羽色分離或出現新的羽色。雞的羽色由多種色素共同作用而形成，麻羽色基因由E(Extension)座位的2個以上等位基因控制[8]，但顯性白羽基因在其它羽色中占主導地位，由于母本為白色羅曼粉蛋雞，盡管父本為長順綠殼蛋雞，但F1代中仍出現了較多白羽雛雞。因此，如利用隱性白羽蛋雞，則會出現較好的毛色體現，但獲得隱性白羽雞作為育種素材則較為困難。而出現的黑羽則有可能是父本長順綠殼蛋雞混有黑羽雞的血統，導致F1代中出現了黑羽性狀的分離。曾道曙等[9]利用長順綠殼蛋雞與隱性矮小白雞雜交，雜交一代黃麻羽母雞占比70.69%，深麻羽為22.20%，麻羽比例高達92.89%，這是由于母本為隱性白羽，從而獲得的F1代可用于替代長順綠殼蛋雞。本試驗F1代麻羽出現了與長順綠殼蛋雞親本類似的麻羽和紅褐色羽2種顏色，此種顏色的個體可留作開發為替代長順綠殼蛋雞的父母代，新出現的黑羽可在開發中淘汰或作為生產配套系使用，而白羽可和羅曼粉蛋雞作進一步的級進雜交，用以產生高產綠殼蛋雞和純系使用。

為了利用好長順綠殼蛋雞品種資源、快速篩選出攜帶綠殼基因的個體且提高雜交群體的產蛋率，本試驗利用分子標記快速篩選長順綠殼蛋雞父代的綠殼基因，并根據篩選數據進行組建家系，獲得了若干攜帶綠殼基因的雜交群體，加快了選育進度。Wang等[6]發現逆轉錄病毒EAV-HP元件的反向插入到SLCO1B3基因5′-非編碼區后，可使得SLCO1 B3在輸卵管殼腺部特異性高表達，導致母雞產綠殼蛋，并將該綠殼基因定位到1號染色體中[6]。國外學者Wragg等[7]也報道了類似研究，但所用分子標記比Wang等更準確。本試驗檢測了長順綠殼蛋雞公雞的綠殼基因型，篩選出純合和雜合的父本后在和羅曼粉母雞進行雜交，結果表明，純合父本長順綠殼蛋雞和羅曼粉蛋雞的F1代為雜合產綠殼蛋蛋的基因型(LC/N)，公、母雛綠殼基因型分別為82.3%和82.8%。本試驗通過對雜交群體的生長性能、羽色等分析，有望通過級進雜交培育出替代長順綠殼蛋雞且產蛋量高的雜交群體。

家禽早期體重是肉用禽類育種的目標，也是衡量肉雞生長、生產能力的重要性狀[10]。本試驗中，1～5周齡F1代雜交母雞與羅曼粉親代相比，體重差異不顯著，第6周齡開始，F1代雜交群體母雞的體重均極顯著低于同周齡羅曼粉母雞(P<0.01)，并未表現出明顯的雜種優勢。這有可能和父本長順綠殼蛋雞有關。謝卓君等研究了清遠麻雞和隱性白羽蛋雞的雜交一代，結果表明，雜交F1代母雞體重和體型均比其母本矮小隱性白羽蛋雞更大，F1代公雞體重小于其父本清遠麻公雞[11]。劉嘉等[12]比較了綠殼蛋雞和蘆花雞的雜交后代體尺性狀，結果表明，雜交一代胸深和脛圍均小于父母代。賀興龍[13]則研究了蘇禽綠殼蛋雞和白來航蛋雞正、反交雜交一代的生長性狀，結果表明，不論是白來航公雞和蘇禽綠殼蛋雞母雞雜交F1代，還是蘇禽綠殼蛋雞公雞和白來航母雞的反交結果，40周齡雜交1代公、母雞體重均比其對應的父母代親本體重小。姜慧繪[14]探討了長順綠殼蛋雞公雞和矮小隱性白雞母雞雜交一代的體重，結果表明，雜交一代的體重接近長順綠殼蛋雞。本試驗用長順綠殼蛋雞和羅曼粉蛋雞進行雜交，F1代母雞比母本體重較輕，說明長順綠殼蛋雞作為我國優良的地方品種，雖然經過了一定的人工選擇，但仍然具有生長緩慢的特點，F1代雛雞受到了父本遺傳效應的影響較大，也可能和不同的雜交組合及長順綠殼蛋雞的純度有關。

4 結論

雜交F1代初生以與羅曼粉母本為主的白羽，占比64.03%，白羽可和羅曼粉蛋雞作進一步的級進雜交，用以產生高產綠殼蛋雞。成年雜交F1代公雞和母雞均出現羽色分化或變異，出現了與長順綠殼蛋雞親本類似的麻羽和紅褐色羽2種顏色，占比24.37%，此種顏色的個體也可留作開發為替代長順綠殼蛋雞的父母代或參與到后續的級進雜交中，新出現的黑羽占比11.60%，可在開發中淘汰或作為生產商品代時為配套系使用；雜交F1代母雞體重和體型均比其母本小，且差異極顯著，后續可通過級進雜交再做進一步的生長性能測定，以期達到和羅曼粉蛋雞相似的體重水平和產蛋性能。因此，通過后續的雜交試驗和橫交固定選育，有望培育出高產的可替代長順綠殼蛋雞的父母代親本及純系。