腎陽虛帶狀皰疹后遺神經痛大鼠模型的建立與評價

丘雅丹，謝 芳，黃佳敏，付夢思，唐 挺,2★

（1.貴州中醫藥大學，貴州 貴陽 550002；2.貴州中醫藥大學第一附屬醫院皮膚科，貴州 貴陽 550001）

帶狀皰疹后遺神經痛（postherpetic neuralgia，PHN）是一種復雜且特殊的慢性神經病理性疼痛，其發病機制非常復雜，目前仍未完全闡明。諸多研究表明，中醫藥單獨使用或與其他療法聯合使用，在臨床痛癥相關疾病的治療中發揮著重要作用。建立合理、科學、可行的中醫證候疾病模型，有助于基于中醫基礎理論深入探究疾病的發病機制。本研究為更好地模擬臨床患者體質，擬構建腎陽虛PHN 大鼠模型，并對其進行評價。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

SD 健康雄性大鼠30 只，SPF 級，體重300 ～350 g/只，購自長沙市天勤生物技術有限公司，動物許可證號：SCXK（湘）2019-0014。將大鼠分籠飼養，自由飲食，室內濕度、溫度恒定，12 h/12 h 明暗周期。適應性飼養1 周后進行耳釘標記編號，稱取并記錄大鼠的體重。隨機將大鼠分為空白對照組和模型組，每組各15 只。

1.2 實驗主要藥品及試劑

甲巰咪唑片〔默克制藥（江蘇）有限公司，進口藥品注冊證號J20171078〕；Vero 細胞（非洲綠猴腎細胞）（武漢普諾賽生命科技有限公司，CL-0242）；蘇木素- 伊紅（HE）染液；cAMP ELISA Kit（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）；cGMP ELISA Kit（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）。

1.3 實驗主要儀器

10 μL 微量注射器（Hamilton）；Von Frey 電子測痛儀（上海玉研科學儀器有限公司）；YLS-21A 型智能冷熱板測痛儀（天津諾雷信達科技有限公司）；RM2235 石蠟切片機（德國徠卡公司）；CO2培養箱（美國Thermal Fisher Scientific 公司）。

2 實驗方法

2.1 無細胞水痘-帶狀皰疹病毒（VZV）懸液的制備

當鏡下觀察到Vero 細胞貼壁生長且形態正常，細胞密度達80% 時，加入VZV 標本液，吸附2 h 后，加入含有2% FBS 的MEM 完全培養基，每日觀察Vero 的形態變化。當80% 細胞出現致細胞病變效應（Cytopathic effect，CPE）時，用細胞刮將細胞刮下，并用移液器進行吹打，隨后分裝收集至凍存管中，置于-80 ℃冰箱中反復凍融3 次后收集培養液，在4 ℃下離心30 min（轉速3500 r/min），收集上清液即得無細胞病毒懸液。采用蝕斑法檢測VZV 滴度后，置于-80 ℃冰箱中貯藏、備用。

2.2 腎陽虛PHN 大鼠模型的構建

首先參照文獻[1-2]中的方法，給予模型組大鼠甲巰咪唑混懸液10 mg/kg（溶液現用現配）灌胃，給藥體積為10 mL/kg；給予空白對照組大鼠同體積生理鹽水灌胃。連續灌胃15 d 后，評估并篩選出建立成功的腎陽虛大鼠模型，同時參照文獻[3]中的方法構建腎陽虛PHN 大鼠模型：運用自制大鼠固定器固定好大鼠后，暴露大鼠右后足，用微量注射器于大鼠右足蹼底部皮下注射50 μL 病毒接種液，空白對照組大鼠右足蹼底部皮下注射50 μL 生理鹽水。

2.3 腎陽虛PHN 大鼠模型的評估

2.3.1 一般情況觀察及腎陽虛動物模型癥狀體征的評價 參照腎陽虛動物模型癥狀體征評估[4]標準，密切觀察兩組大鼠的一般情況，包括精神狀態、活動情況、皮毛狀態、飲食飲水、二便等情況，并記錄。

2.3.2 大鼠體質量及肛溫的測量 分別于腎陽虛大鼠模型建立前及造模完成后，稱量并記錄兩組大鼠的體質量，并采用電子肛溫儀對其肛溫進行測量。

2.3.3 腎陽虛動物模型客觀指標的檢測 末次灌胃結束且禁食12 h 后，經腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉，用一次性無菌采血針采集股靜脈血，靜置20 min 后于4 ℃下離心15 min（轉速3000 r/min），收集上清血漿，采用酶聯免疫吸附（ELISA）法及配套的試劑盒檢測血漿中的cAMP、cGMP 水平，并計算cAMP/cGMP。

2.3.4 大鼠疼痛行為學檢測 分別于建模前及注射VZV 懸液后的第3、7、14、21、28 d，在觀察完各組大鼠的一般情況后，運用Von Frey 電子測痛儀測量各組大鼠的機械縮爪閾值（PawWithdrawalThreshold，PWT）和熱撤回潛伏期（ThermalWithdrawalLatency，TWL；也叫熱痛縮足閾值）。

2.3.4.1 PWT 檢測（Von Frey 試驗）參照Vivancos 等[5]的方法，將各組大鼠分批放入帶絲網層的塑料籠中，等待30 min 讓其安靜，然后使用Von Frey 電子測痛儀以“上、下”的方法，刺激大鼠的后爪內側皮膚，力度為使大鼠腳爪輕度彎曲，持續1.5 s，當大鼠出現嘶吼、舔足、甩尾及彈腿任一行為時即為陽性疼痛反應，記錄此時電子Von Frey 測痛儀的數值，該數值即為PWT。每只大鼠均重復測量3 次，中間間隔5 min，將3 次測量的平均值作為PWT。

2.3.4.2 TWL 檢測（熱痛敏試驗）參照Hargreaves 等[6]的方法，測量各組大鼠的TWL。每次PWT 測量結束30 min 后，將各組大鼠分批置于智能冷熱板測痛儀上，溫度保持為（50±2）℃。當大鼠出現后爪抬起、舔足及甩尾任一行為時，記錄此時大鼠在熱板上所用的時間，該時間即為TWL。每只大鼠均重復測試3 次，中間間隔10 min，取其平均值。

2.3.5 大鼠脊髓組織病理形態的觀察 在注射VZV 懸液3 d 后，每組隨機抽取5 只大鼠進行脊髓組織的采集，并進行HE 染色。

3 統計學方法

使用SPSS 26.0 軟件及GraphpadPrism9 程序進行統計分析，計量資料用均值± 標準差（±s）表示，P＜0.05 認為差異具有統計學意義。

4 結果

4.1 一般情況觀察

4.1.1 腎陽虛動物模型癥狀體征的評價結果 在實驗過程中，空白對照組大鼠精神狀態良好，活動機警靈敏，皮毛光亮柔順，飲食、飲水及二便均無異常表現。造模完成后，模型組大鼠與空白對照組大鼠比較，出現精神萎靡、毛色枯燥、喜扎堆蜷縮等表現。

4.1.2 兩組大鼠造模前后體質量的比較 空白對照組、模型組大鼠造模前的體質量比較（P＞0.05）。造模后，模型組大鼠的體質量較空白對照組低，其體質量總增長量顯著小于空白對照組大鼠（P＜0.05）。詳見表1。

表1 兩組大鼠造模前后體質量的比較（g，± s）

表1 兩組大鼠造模前后體質量的比較（g，± s）

注：*與空白對照組比較，P ＜0.05。

組別 造模前體質量 造模15 d 后體質量 體質量總增長量空白對照組（n=15）332.60±9.95 486.20±29.46 153.60±20.47模型組（n=15）335.30±8.45 422.70±30.28* 95.00±13.57*

4.1.3 兩組大鼠造模前后肛溫的比較 造模前，兩組大鼠的肛溫比較（P＞0.05）。造模后，與空白對照組大鼠比較，模型組大鼠的肛溫顯著降低（P＜0.05）。詳見表2。

表2 兩組大鼠造模前后肛溫的比較（℃，± s）

表2 兩組大鼠造模前后肛溫的比較（℃，± s）

注：*與空白對照組比較，P ＜0.05。

組別 造模前肛溫 造模后肛溫空白對照組（n=15）37.40±0.10 37.41±0.11模型組（n=15）37.37±0.11 36.29±0.12*

4.2 兩組大鼠血漿中cAMP、cGMP 含量的比較

采用ELISA 法檢測兩組大鼠血漿中cAMP 和cGMP 的含量，結果顯示，與空白對照組大鼠比較，模型組大鼠的血漿cAMP 含量、cAMP/cGMP 顯著降低，血漿cGMP 含量顯著升高（P＜0.05）。詳見表3。

表3 兩組大鼠血漿中cAMP、cGMP 含量的比較（± s）

表3 兩組大鼠血漿中cAMP、cGMP 含量的比較（± s）

注：*與空白對照組比較，P ＜0.05。

組別 cAMP（pmol/mL）cGMP（pmol/mL）cAMP/cGMP空白對照組（n=15）15.79±1.22 2.77±0.26 5.75±0.71模型組（n=15）9.48±2.42* 6.24±0.42* 1.52±0.36*

4.3 兩組大鼠PWT 的比較

注射VZV 之前（D0），兩組大鼠的PWT 比較（P＞0.05）。VZV 注射3 d 后，與空白對照組大鼠相比，模型組大鼠的 PWT 明顯降低（P＜0.05）。第7 ～14 d，模型組大鼠的PWT 下降最快（P＜0.05），至第21 d 時，模型組大鼠的PWT 降至最低（P＜0.05）。空白對照組大鼠的PWT 在觀察期內無明顯變化（P＞0.05）。詳見圖1。

圖1 兩組大鼠PWT 的比較

4.4 兩組大鼠TWL 的比較

注射VZV 之前（D0），兩組大鼠的TWL 比較（P＞0.05）。VZV 注射3 d 后，與空白對照組大鼠相比，模型組大鼠的TWL 明顯降低（P＜0.05）。第7 ～14 d，模型組大鼠的TWL 下降最快（P＜0.05），至第21 d 時，模型組大鼠的TWL 降至最低（P＜0.05）。空白對照組大鼠的TWL 在觀察期內無明顯變化（P＞0.05）。詳見圖2。

圖2 兩組大鼠TWL 的比較

4.5 大鼠脊髓組織病理形態學的觀察

模型組：可見髓鞘變性腫脹，脂質空泡形成，并可觀察到病毒感染神經元的包涵體，呈嗜酸性、散在的、局部的炎癥細胞浸潤，小灶性出血；空白對照組：可見脊髓正常神經細胞及膠質細胞，血管出血并見少量散在的炎癥細胞浸潤。如圖3 所示。

圖3 大鼠的脊髓組織病理切片

5 討論

目前，構建腎陽虛大鼠模型的方法主要有中醫傳統病因法、藥物造模法、手術造模法和多因素聯合造模法[7-8]。其中，藥物造模和手術造模主要是通過藥物或手術手段使大鼠對應的靶腺體功能紊亂[9]，從而達到造模的目的。與手術造模相比，藥物造模操作相對簡單，且大鼠的傷亡率低，故應用較為廣泛。在藥物造模方法中，常用的藥物包括糖皮質激素、抗甲狀腺藥、性激素、羥基脲和腺嘌呤等[1]。本研究結合研究目的及藥物對PHN 的影響，選擇甲巰咪唑灌胃的方式建立腎陽虛大鼠模型，并在此基礎上進行PHN 大鼠模型的構建。PHN 大鼠模型目前主要有VZV 模型、樹脂毒素（Reziniferatoxin，RTX）模型、Ⅰ型單純皰疹病毒（HSV-1）模型、氯仿皮膚痛敏模型及猴水痘病毒（Simian Varicella virus，SVV）模型，其中應用較多的是VZV 模型、RTX 模型[10]。Fleetwood-Walker 等[11]在前人研究的基礎上，單次將高滴度VZV 接種到大鼠足墊中，發現大鼠出現了可測量和長期存在的疼痛行為指標，其中大鼠出現的長期行為變化模擬了PHN 發生后機械性異常疼痛及熱痛覺過敏的特征，而這種造模方式現已被許多的研究小組成功復制。另外，在大鼠的胡須墊中接種VZV 也會出現可測量的疼痛指標，但考慮到疼痛發生的部分及檢測方式受限，故本研究中不采用此種造模方式。將RTX 注入大鼠單側腹膜內建立的神經病理性疼痛動物模型也可以緩慢形成機械痛覺過敏及異常疼痛，也具有熱痛覺閾值升高且不能用抗病毒藥物進行拮抗的特點。似乎該模型更適合作為PHN 的理想動物模型，但是其發病因素很難解釋PHN 的病因和誘發因素。因此，本實驗選擇參照Dalziel 等[3]的方法，在腎陽虛大鼠模型的基礎上，于大鼠足蹼部位接種VZV，并觀到類似的結果，大鼠出現了持續性的痛覺過敏，且異常痛敏持續至第28 d 左右。

綜上所述，通過甲巰咪唑灌胃15 d 聯合大鼠足蹼部注射VZV 構建腎陽虛PHN 大鼠模型是可行的。