人β防御素3和γ干擾素在MAPK信號通路中的相互誘導及聯合抗甲型流感病毒的機制*

唐源,祝潔,楊小余,張乙進,羅紅,江滟,3***

(1.貴州醫科大學 醫學檢驗學院 臨床微生物與免疫學教研室,貴州 貴陽 550004;2.貴州醫科大學 實驗動物中心,貴州 貴陽 550025;3.貴州醫科大學附屬醫院 臨床檢驗中心 微生物免疫科,貴州 貴陽 550004)

甲型流感病毒(influenza A virus,IAV)是常見的呼吸道病原體,具有高度傳染性[1-3]。據報道,IAV 感染每年可導致29萬～65萬人死亡,嚴重威脅人類健康[4]。黏膜上皮細胞分泌的抗病毒蛋白可直接殺死流感病毒、激活吞噬細胞并誘導其他抗病毒蛋白的產生[5-6]。β防御素3(β defensin-3,BD-3)屬于抗菌肽家族[7],處于抗病毒免疫的第一道防線,BD-3和γ干擾素(interferon-γ,IFN-γ)在IAV感染早期表達顯著上調[8-9]。本課題組前期研究表明,BD-3可抑制IAV進入細胞,并增強小鼠對流感病毒的抵抗力[10];此外,還可誘導其他抗病毒蛋白的生成、抑制IAV復制[10]。例如,BD-3可誘導NK細胞分泌抗病毒蛋白IFN-γ[11],IFN-γ是Ⅱ型干擾素的唯一成員,其產生對于病毒的清除和適應性免疫反應的發生發展至關重要。盡管IFN-γ不能直接殺死IAV,但是它可誘導干擾素刺激基因 (interferon-stimulated genes,ISGs)來抑制IAV[12-14]。研究表明,在角質細胞和人臍靜脈內皮細胞中,IFN-γ可誘導人β防御素3(human β defensin-3,HBD3)的表達[15- 16],并認為HBD3和IFN-γ的表達均與絲裂源活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路的激活相關[17-18],但其中的機制仍不清楚。本研究基于MAPK通路,探討在人支氣管上皮細胞(human bronchial epithelial cell line,HBEpiC)BEAS-2B中,HBD3和IFN-γ在抗IAV中的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1細胞和病毒株 BEAS-2B細胞購自中國科學院昆明細胞庫,IAVA/PR/8/34(H1N1)毒株由本實驗室保存。

1.1.2主要試劑 BEAS-2B細胞及其專用無血清培養基KCB M006購自中國科學院昆明細胞庫,DMEM高糖培養基購自美國Gibco公司,IFN-γ購自美國Proteintech公司,HBD3購自Novus公司,P38 MAPK通路抑制劑SB203580,EPK通路抑制劑U1026及JNK通路抑制劑SP600125購自上海碧云天公司,siHBD3、siNC由廣州銳博公司設計合成;riboFECTTMCP 轉染試劑購自廣州銳博公司,IFN-γ中和抗體、對照抗體購自美國R&D公司,總RNA提取試劑盒購自北京天根生物有限公司,逆轉錄試劑盒購自大連Takara生物有限公司,酶聯免疫吸附實驗 (ELISA)試劑盒購自武漢Elabscience公司,p38 MAPK、p-p38 MAPK、ERK及p-ERK抗體購自美國CST公司,JNK、p-JNK抗體購自美國Abcam公司,H1N1核蛋白(NP)抗體購自北京博奧森生物技術有限公司,GAPDH抗體、羊抗兔IgG二抗購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 研究方法及觀察指標

1.2.1細胞培養 BEAS-2B細胞采用BEAS-2B細胞專用無血清培養基KCB M006,在37 ℃、5% CO2環境下培養。

1.2.2病毒增殖 H1N1接種于9 d齡雞胚尿囊腔中進行增殖,37 ℃培養48 h后收集雞胚尿囊液,過濾后于-80 ℃保存。

1.2.3IFN-γ與HBD3 將BEAS-2B細胞以每孔1×108個/L接種于6孔板,培養48 h后吸棄培養基,分為對照組、不同濃度HBD3或IFN-γ處理組、25.0 μg/L IFN-γ組或1.00 mg/L HBD3組。對照組加入新鮮無血清DMEM培養基分別培養4 h、12 h、24 h、48 h;不同濃度HBD3或IFN-γ處理組分別用不同濃度的HBD3(0.25、0.50、1.00、2.00 mg/L)或IFN-γ(12.5、25.0、50.0、100.0 μg/L)處理細胞12 h;25.0 μg/L IFN-γ組或1.00 mg/L HBD3組分別處理BEAS-2B細胞4 h、12 h、24 h、48 h。

1.2.4MAPK通路抑制劑 將BEAS-2B細胞以每孔1×108個/L接種于6孔板,培養48 h后吸棄培養基,對照組加入新鮮無血清DMEM培養基培養4 h,其余各組分別使用p38 MAPK通路抑制劑SB203580(20 μmol/L)、ERK通路抑制劑U1026(20 μmol/L)、JNK通路抑制劑SP600125(10 μmol/L)處理BEAS-2B細胞1 h,吸棄上清后,用25.00 μg/L IFN-γ或1.00 mg/L HBD3處理細胞4 h。

1.2.5病毒感染和干預 BEAS-2B細胞以再孔1×108個/L接種于6孔板,48 h后吸棄上清,分為對照組、HBD3和/或IFN-γ處理組、對照siRNA組(siNC)、HBD3 siRNA組(siHBD3)、對照抗體組(Control Ab組)、IFN-γ中和抗體組(IFN-γ Ab組)。對照組加入新鮮無血清培養基進行培養;HBD3和/或IFN-γ處理組分別用HBD3(1.00 mg/L)和/或IFN-γ(25.0 μg/L)處理細胞12 h后,5×TCID50H1N1感染BEAS-2B細胞1 h,吸棄上清,加入無血清DMEM處理12 h。siNC組、siHBD3組分別轉染對照siRNA(siNC,N Control_05815)或30 nmol/L hBD3 siRNA(siHBD3:5′-UGUGGAAAUGCCUUCUUAA-3′) 24 h,之后加入HBD3(1.00 mg/L)和/或IFN-γ(25.0 μg/L)處理細胞12 h后,5 × TCID50H1N1感染BEAS-2B細胞1 h,吸棄上清,加入無血清DMEM處理12 h。Control Ab組、IFN-γ Ab組分別用Control Ab(0.5 mg/L)或IFN-γ Ab(0.5 mg/L)以及HBD3(1.00 mg/L)和/或IFN-γ(25.0 μg/L)共同處理細胞12 h后,5×TCID50H1N1感染BEAS-2B細胞1 h,吸棄上清,加入無血清DMEM處理12 h。

1.2.6實時熒光定量PCR(quantitative reverse transcription,qRT-PCR)檢測目的分子基因水平 按照總RNA提取試劑盒步驟提取細胞總RNA,根據逆轉錄試劑盒操作說明將RNA逆轉錄為cDNA,將相應的引物序列(表1)、cDNA、Ultra-SYBR Mixture等試劑按照說明書上的比例加入PCR 8聯管中、置于實時熒光定量PCR儀。反應結束后記錄各組Ct值,所有樣本均設置3個復孔,以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)作為內參,使用2-ΔΔCt法分析相對基因表達量。

表1 qRT-PCR引物序列Tab.1 The primer sequences used for qRT-PCR

1.2.7酶聯免疫吸附試驗 (enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測HBD3和IFN-γ的蛋白量 處理后的BEAS-2B細胞用1×PBS洗滌2次后超聲破碎細胞,隨后12 000 r/min離心10 min,收集上清液,按照試劑盒操作說明書測定HBD3和IFN-γ的蛋白量。

1.2.8Western blot檢測蛋白表達量 蛋白樣品(20 μg)經12% SDS-PAGE電泳分離蛋白,分離結束后濕轉到PVDF膜上。3%牛血清白蛋白封閉2 h,加入相應一抗4 °C過夜。之后,用1× TBST洗膜3次,加入二抗室溫搖床孵育1 h。使用電化學發光法對蛋白條帶進行顯影,并通過Image J軟件對條帶進行灰度值分析。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 IFN-γ與HBD3相互誘導表達

濃度為12.5、25.0、50.0、100.0 μg/L IFN-γ分別處理BEAS-2B細胞12 h后,HBD3 mRNA和蛋白表達與對照組相比明顯增加(t=4.308、7.334、5.972、3.747,P<0.05或P<0.01;t=70.67、123.8、82.26、58.13,P<0.01),25.0 μg/L IFN-γ作用時HBD3蛋白表達達到峰值(t=50.21、36.31、51.7,P<0.01);0.25、0.50、1.00、2.00 mg/L HBD3分別處理細胞12 h后,IFN-γ的mRNA和蛋白表達與對照組相比明顯增加 (t=3.914、4.920、5.544、3.809,P<0.05或P<0.01;t=5.748、3.600、10.550、6.305,P<0.05或P<0.01),在1.00 mg/L HBD3作用時IFN-γ蛋白表達達到峰值(t=4.52、9.96、4.82,P<0.05或P<0.01)。用25.0 μg/L IFN-γ或1.00 mg/L HBD3分別處理BEAS-2B細胞4、12、24及48 h的結果顯示,25.0 μg/L IFN-γ處理不同時間,HBD3的mRNA和蛋白表達與對照組相比明顯增加(t=5.354、7.334、4.027,P<0.05或P<0.01;t=109.70、123.80、53.06、28.94,P<0.05或P<0.01),在12 h達到峰值;1.00 mg/L HBD3處理不同時間后,IFN-γ的mRNA和蛋白表達增加(t=5.852、8.727、5.544,P<0.01;t=22.890、10.550、9.221,P<0.01),在12 h達到峰值。見圖1、圖2。結果表明,IFN-γ與HBD3在BEAS-2B細胞中可相互誘導表達,最佳誘導濃度分別為25.0 μg/L和1.00 mg/L,最佳誘導時間為12 h。

注:A、B為不同濃度IFN-γ對HBD3 mRNA及蛋白表達的影響,C、D為25.0 μg/L IFN-γ作用不同時間對HBD3 mRNA及蛋白表達的影響;與對照組(Con組)相比,(1)P<0.05,(2)P<0.01;與25.0 μg/L IFN-γ組相比,(3)P<0.01。圖1 IFN-γ對BEAS-2B細胞HBD3 mRNA及蛋白表達的影響Fig.1 Effect of IFN-γ on HBD3 mRNA and protein expression in BEAS-2B cells

2.2 IFN-γ和HBD3通過MAPK通路相互誘導表達

用不同濃度的IFN-γ(100.0、50.0、25.0、12.5 μg/L)處理BEAS-2B細胞12 h,Western blot結果顯示,與對照組相比,p-JNK、p-ERK、p-p38 MAPK表達均明顯增加(t=10.720、10.450、8.436、8.038,P<0.01;t=10.47、33.22、12.52、70.06,P<0.01;t=13.250、13.720、8.366,P<0.01;圖3)。不同濃度的HBD3(2.00、1.00、0.50、0.25 mg/L)處理BEAS-2B細胞12 h后,Western blot結果顯示,與對照組相比,p-JNK在1.00 mg/L HBD3作用時表達顯著增加(t=7.015,P<0.01),p-ERK、p-p38 MAPK表達均明顯增加(t=10.720、11.570、17.160、6.066,P<0.01;t=20.27、18.25、17.18、18.24,P<0.01;圖4)。采用p38 MAPK通路抑制劑SB203580(20 μmol/L)、ERK通路抑制劑U0126(20 μmol/L)或JNK通路抑制劑SP600125(10 μmol/L)預處理BEAS-2B細胞,結果顯示,與25.0 μg/L IFN-γ組或1.00 mg/L HBD3組相比,SB203580、U0126及SP600125預處理可明顯降低IFN-γ誘導HBD3 mRNA及蛋白水平的增加(t=7.640、5.571、8.053,P<0.01;t=52.23、58.04、67.28,P<0.01)及HBD3誘導IFN-γ mRNA及蛋白水平的增加(t=4.718、5.484、4.927,P<0.01;t=5.395、5.599、6.234,P<0.01;圖5)。以上結果表明,IFN-γ和HBD3可通過MAPK通路相互誘導表達。

注:A、B為不同濃度HBD3對BEAS-2B細胞中IFN-γ mRNA及蛋白的表達的影響,C、D為1.00 mg/L HBD3作用不同時間對BEAS-2B細胞IFN-γ mRNA及蛋白表達的影響;與對照組(Con組)相比,(1)P<0.05,(2)P<0.01;與1.00 mg/L HBD3組相比,(3)P<0.05,(4)P<0.01。圖2 HBD3對BEAS-2B細胞IFN-γ mRNA及蛋白表達的影響Fig.2 Effect of HBD3 on IFN-γ mRNA and protein expression in BEAS-2B cells

注:A為p-JNK、JNK、p-ERK、ERK、p-p38 MAPK、p38 MAPK蛋白條帶結果,B、C、D為p-JNK/JNK、p-ERK/ERK、p-p38 MAPK/p38 MAPK比值;(1)與對照組(Con組)相比,P<0.01;與25.0 μg/L IFN-γ組相比,(2)P<0.05,(3)P<0.01。圖3 IFN-γ作用后BEAS-2B細胞p-p38 MAPK、p-ERK、p-JNK 蛋白表達Fig.3 Expression of p-p38 MAPK,p-ERK,and p-JNK protein in BEAS-2B cells after IFN-γ treatment

注:A為p-JNK、JNK、p-ERK、ERK、p-p38 MAPK、p38 MAPK蛋白條帶結果,B、C、D為p-JNK/JNK、p-ERK/ERK、p-p38 MAPK/p38 MAPK定量結果;(1)與對照組(Con組)相比,P<0.01;與1.00 mg/L HBD3組相比,(2)P<0.05,(3)P<0.01。圖4 HBD3作用后BEAS-2B細胞p-p38 MAPK、p-ERK、p-JNK 蛋白表達Fig.4 Expression of p-p38 MAPK,p-ERK,and p-JNK protein in BEAS-2B cells after HBD3 treatment

注:A、B分別為HBD3 mRNA相對表達水平及蛋白濃度,C、D分別為IFN-γ mRNA相對表達水平及蛋白濃度;(1)與單獨IFN-γ(25.0 μg/L)+或HBD3(1.00 mg/L)+組相比,P<0.01;(2)與SB203580、U0126、SP600125、0.1%DMSO、IFN-γ全-組相比,P<0.01。圖5 MAPK通路抑制劑對BEAS-2B細胞HBD3和IFN-γ表達水平的影響Fig.5 Effect of MAPK pathway inhibitors on the expression level of HBD3 and IFN-γ in BEAS-2B cells

2.3 IFN-γ和HBD3相互誘導增強抗IAV作用

用25.0 μg/L IFN-γ和/或1.00 mg/L HBD3處理BEAS-2B細胞12 h后,用5×TCID50H1N1感染細胞1 h。結果顯示,HBD3和IFN-γ單獨或聯合作用均可有效抑制H1N1 NP mRNA及蛋白表達(t=7.986、4.645、12.090,P<0.01;t=20.22、13.20、25.37,P<0.01),且2者聯合使用對H1N1 NP mRNA及蛋白表達的抑制效果更佳(t=4.105、7.445,P<0.05或P<0.01;t=5.150、12.170,P<0.05或P<0.01);轉染siHBD3或IFN-γ中和抗體作用后,用5×TCID50H1N1感染細胞1 h,H1N1 NP的mRNA及蛋白水平的結果顯示,siHBD3轉染顯著減弱了IFN-γ對H1N1 NP mRNA及蛋白的抑制作用(t=17.25,P<0.01;t=16.92,P<0.01);然而,IFN-γ中和抗體作用后HBD3對H1N1 NP mRNA及蛋白的抑制作用均無顯著影響(t=2.00,P>0.05;t=0.44,P>0.05)。見圖6、圖7。

3 討論

黏膜上皮細胞分泌的抗病毒蛋白在IAV感染過程中發揮著重要作用,病毒感染早期或期間誘導抗病毒蛋白的生成有助于提高宿主抵抗病毒的能力[19]。研究表明,在BEAS-2B細胞中,表沒食子兒茶素沒食子酸酯可誘導IFN-λ的分泌抑制IAV感染[20]。此外,流感病毒感染后呼吸道上皮細胞分泌的BD-3和IFN-γ在宿主恢復過程中也起著重要的作用[8-9]。BD-3屬于β防御素家族,具有很強的抗病毒活性。BD-3可通過破壞IAV的包膜,阻止IAV進入細胞并誘導其他抗病毒蛋白的生成來抑制IAV[10]。IFN-γ由活化的T細胞、NK細胞及呼吸道上皮細胞生成[8,21-24]。IFN-γ的生成對病毒的清除及適應性免疫的發展至關重要,其可通過誘導ISGs的表達抑制IAV復制[13-14]。盡管之前的研究已表明BD-3及IFN-γ可抑制IAV,但2者的抗IAV機制仍不清楚,進一步探索BD-3及IFN-γ的抗IAV機制有助于更好地防治IAV感染。

注:A、B、C表示H1N1 NP mRNA表達水平;(1)與單H1N1+組相比,P<0.01;與H1N1、IFN-γ、HBD3全+組相比,(2)P<0.05,(3)P<0.01;(4)與H1N1、IFN-γ、siHBD3全+組相比,P<0.01。圖6 BEAS-2B細胞H1N1、IFN-γ、HBD3、siHBD3、IFN-γ Ab單獨或聯合作用對H1N1 NP mRNA表達的影響Fig.6 Effects of H1N1,IFN-γ,HBD3,siHBD3,and IFN-γ Ab alone or their combination on H1N1 NP mRNA expression in BEAS-2B cells

注:A、C、E分別為NP蛋白條帶結果,B、D、F為NP蛋白定量結果;(1)與單H1N1+組相比,P<0.01;與H1N1、IFN-γ、HBD3全+組相比,(2)P<0.05,(3)P<0.01;(4)與H1N1、IFN-γ、siHBD3全+組相比,P<0.01。圖7 BEAS-2B細胞H1N1、IFN-γ、HBD3、siHBD3、IFN-γ Ab單獨或聯合作用對H1N1 NP蛋白表達的影響Fig.7 EffectS of H1N1,IFN-γ,HBD3,siHBD3,and IFN-γ Ab alone or their combination on H1N1 NP Protein expression level in BEAS-2B cells

抗病毒蛋白可通過誘導其他抗病毒細胞因子的表達增強其抗病毒功能。此前的研究表明,在不同細胞中BD-3和IFN-γ可相互誘導表達。例如,在角質細胞和人臍靜脈內皮中,IFN-γ可誘導BD-3 mRNA的表達[15-16]且BD-3可誘導NK細胞中IFN-γ的分泌[11]。本研究發現IFN-γ作用后HBD3表達明顯升高,同時,HBD3作用后IFN-γ表達也明顯增加。結果表明,在BEAS-2B細胞中,HBD3與IFN-γ可相互誘導表達。然而,HBD3與IFN-γ的相互誘導并不是劑量依賴性的,這可能與HBD3和IFN-γ免疫調節的雙重作用有關。研究表明,IFN-γ可抑制流感病毒感染后期的抗菌防御[25],而HBD3在抗菌活性及炎癥反應方面有著雙重作用[26]。

多項研究表明,HBD3和IFN-γ的生成與MAPK信號通路相關[17-18]。穿心蓮內酯、冬凌草素及異甘草素可通過p38、ERK、JNK信號通路誘導腸上皮細胞中HBD3的表達,并且牙齦卟啉單胞菌感染后可通過p38、ERK信號通路誘導IFN-γ的生成[27-28]。本研究發現IFN-γ及HBD3可明顯增加p-p38 MAPK、p-ERK及p-JNK蛋白表達,且抑制p38 MAPK、ERK及JNK信號通路后可明顯減少IFN-γ與HBD3的相互誘導表達。以上結果表明,IFN-γ及HBD3可通過MAPK通路相互誘導表達。

HBD3和IFN-γ是重要的抗病毒蛋白[29-30]。本課題組前期研究發現,BD-3可通過抑制IAV吸附和進入過程抑制IAV的復制[10]。也有研究發現,重組鴨IFN-γ在體內外均可抑制流感病毒H5N1的復制[14]。本研究發現HBD3和IFN-γ可顯著抑制H1N1 NP的表達,且HBD3和IFN-γ聯合作用的抑制作用更顯著。這與此前的研究發現IFN-γ可以促進IFNα/β的抗病毒作用相似[31-32]。Tewary等[33]的研究發現,HBD3可增加IFN表達,并增加機體免疫作用。這些結果表明,HBD3與IFN-γ的聯合抗IAV作用可能與其相互誘導作用有關。進一步研究發現,沉默HBD3減弱了IFN-γ對H1N1 NP表達的抑制作用。然而,IFN-γ中和抗體作用后對HBD3抑制H1N1 NP表達的作用無顯著影響。這可能是由于HBD3能夠直接殺死IAV,而IFN-γ必須通過誘導ISGs或其他抗病毒蛋白的生成才能發揮其抗病毒活性。然而,本研究中HBD3誘導IFN-γ生成的量不足以誘導ISGs或其他抗病毒蛋白的生成。

綜上所述,本研究結果表明,在BEAS-2B細胞中,HBD3和IFN-γ可通過MAPK信號通路相互誘導發揮抗IAV作用。這一結果也揭示了宿主免疫蛋白HBD3及IFN-γ抗IAV的新機制。但HBD3和IFN-γ的抗病毒作用不僅限于誘導相關的抗病毒蛋白,還包括免疫細胞的激活、適應性免疫及免疫平衡的調節[34-35]。為了全面了解HBD3和IFN-γ相互誘導抑制IAV的機制,在之后的研究中將使用動物模型研究HBD3和IFN-γ的相互誘導機制以及其在體內的抗IAV作用,為HBD3和IFN-γ的臨床應用建立理論基礎。