燃煤氟對雌性大鼠下丘腦、垂體、卵巢臟器系數及組織TGF-β1表達的影響*

黃燕子,喻茂娟,柳青

(1.貴州醫科大學 公共衛生學院,貴州 貴陽 550004;2.貴陽市云巖區疾病預防控制中心 疾控科,貴州 貴陽 550004;3.南通市衛生健康委員會 疾病預防控制處,江蘇 南通 226000)

地方性燃煤型氟中毒(簡稱燃煤型氟中毒)是由于居民使用高氟煤污染環境介質或食物引起的以氟斑牙和氟骨癥為主要特征的一種慢性全身性疾病[1]。在燃煤氟中毒的機制研究中,最早且較多屬骨相方面的損害,隨著對氟中毒研究的深入,近年來研究熱點逐漸轉向非骨相改變,尤其是生殖系統方面[2-3]。轉化生長因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)屬于一類細胞調節因子,在女性生殖系統疾病中,TGF-β1有重要調節作用[4-6],動物實驗發現,TGF-β1不僅能調控卵巢中卵泡的發育,而且在機體免疫-神經-內分泌網絡中起到了關鍵作用[7-8],提示TGF-β1與生殖關系密切。本研究模擬病區女性持續氟暴露情況,建立雌鼠燃煤型氟中毒模型,通過檢測雌鼠下丘腦-垂體-卵巢中TGF-β1表達情況,探討氟對雌性大鼠下丘腦-垂體-卵巢功能軸的影響及其可能機制,進一步為防治燃煤氟所致女性生殖系統損害提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物 健康的清潔級雌性SD大鼠120只,由貴州醫科大學實驗中心提供,鼠齡28 d,體質量60～80 g,研究獲學校倫理委員會批準(編號1603185)。

1.1.2主要儀器與試劑 Nikon TE2000-U倒置顯微鏡(日本尼康公司),Leica RM2135型切片機(德國Leica公司)。氟化鈉(分析純,國藥集團化學試劑有限公司),TGF-β1、一抗體、二抗、DAB顯色劑(天津市科密歐化工有限公司)。

1.2 研究方法

SD大鼠適應性喂養1周后,參考文獻[9-10]測定飼料中氟元素含量為(10.38±0.41)mg/kg、自來水氟元素濃度為(0.83±0.01)mg/L,均符合非氟中毒地區食物和飲用水標準。大鼠按體質量從小到大排列,采用隨機數字表法隨機分為對照組、低氟組、中氟組和高氟組,每組30只,對照組大鼠給予正常飼料,低、中、高氟組分別用25、50、100 mg/kg的含氟飼料喂養[11-13]。

1.3 檢測指標

1.3.1尿氟檢測 染氟第3、4、5個月時,將待處理的10只SD大鼠放入代謝籠中收集其24 h尿液,采用氟離子選擇電極法測定尿氟離子濃度,參照標準為《尿中氟的離子選擇電極測定方法》(WS/T30-1996)。

1.3.2骨氟檢測 染氟第3、4、5個月時,每組分別處死10只SD大鼠,取其左下肢骨于馬弗爐內灰化,采用氟離子選擇電極法測定骨氟離子濃度,參照標準為《氟離子選擇電極測定法》(WS/T89-1996)。

1.3.3氟斑牙判定 染氟第5個月時,判定SD大鼠氟斑牙情況[14-15](正常,牙釉質呈半透明、橘黃色或棕黃色,色澤度好;輕度,牙釉質出現微小規模的棕白相間橫紋;中度,牙釉質白色橫紋變寬甚至不規則;重度,牙釉質棕色橫紋消失、大部分牙表面呈白粉筆樣)。

1.3.4下丘腦、垂體及卵巢組織臟器系數 染氟第3、4、5個月時,每組分別處死10只SD大鼠,分離下丘腦、垂體及卵巢,稱重計算臟器系數,臟器系數=組織的臟器質量/大鼠體質量。

1.3.5下丘腦、垂體及卵巢組織的TGF-β1表達 染氟第3、4、5個月時,各組分別處死10只SD大鼠,分離下丘腦、垂體及卵巢,用10 %中性甲醛溶液固定24 h、脫水、浸蠟及切片,免疫組化法測定下丘腦、垂體及卵巢組織中TGF-β1的表達情況,同時采用半定量法進行分析,以目標區域染色深淺和面積大小確定靶蛋白的量,染色區域顏色越深說明所測蛋白的量越多。

1.4 統計學分析

應用SPSS 11.5軟件進行數據處理與分析,符合正態分布且方差齊的計量資料,用單因素方差分析進行比較,不同組別之間采用SNK法進行兩兩比較;計數資料采用卡方檢驗,計數資料兩兩比較采用Bonferroni法;雙向有序資料采用線性趨勢檢驗;檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 大鼠尿氟含量

隨著喂養時間延長,4組大鼠尿氟含量增加,對照組大鼠3個時間點尿氟比較、差異無統計學意義(P>0.05),而3個染氟組大鼠尿氟含量組內比較、差異有統計學意義(P<0.05);與對照組比較,除低氟組染氟3、4月大鼠尿氟含量無明顯升高外,其余各染氟組及染氟時間點大鼠的尿氟含量明顯升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠不同時點的尿氟濃度Tab.1 Contents of urinary fluoride of each group in different

2.2 大鼠骨氟含量

隨著喂養時間延長,4組大鼠骨氟含量增加,對照組大鼠3個時間點骨氟比較、差異無統計學意義(P>0.05),而3個染氟組大鼠骨氟含量組內比較、差異有統計學意義(P<0.05);與對照組比較,除低氟組染氟3月大鼠骨氟含量差異無統計學意義(P>0.05),其余各染氟組及染氟時間點大鼠的骨氟含量明顯升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠不同時點骨氟濃度Tab.2 Contents of bone fluoride of each group in different

2.3 大鼠氟斑牙

2.4 大鼠下丘腦、垂體及卵巢組織臟器系數

染氟第3個月時,各染氟組雌性大鼠下丘腦、垂體組織臟器系數比較,差異均無統計學意義(P>0.05) 。染氟第4、5個月時,各染氟組雌性大鼠卵巢組織臟器系數比較,差異有統計學意義(P<0.05),中氟組和高氟組卵巢組織臟器系數高于同時間點的對照組(P<0.05),且高氟組雌性大鼠卵巢組織臟器系數隨染氟時間呈上升趨勢(P<0.05)。見表4～表6。

表3 染氟第5個月時SD大鼠的氟斑牙情況(n=10)Tab.3 Degrees of dental fluorosis of rats in 5 months(n=10)

表4 各組大鼠不同時點下丘腦臟器系數Tab.4 Changes of hypothalamus organ coefficient of each group in different

表5 各組大鼠不同時點垂體臟器系數Tab.5 Changes of pituitary organ coefficients of each group in different

表6 各組大鼠不同時點卵巢臟器系數Tab.6 Changes of the right ovarian organ coefficients of each group in different

2.5 下丘腦、垂體及卵巢組織TGF-β1的表達

2.5.1下丘腦中TGF-β1的表達 染氟第5個月時,各染氟組下丘腦組織TGF-β1表達比較,差異具有統計學意義(P<0.05);與對照組相比較,各染氟組中TGF-β1表達差異均有統計學意義(P<0.05),并隨染氟劑量增加有上升趨勢,但同一染氟組TGF-β1表達水平隨染氟時間先降后升(P<0.05)。見表7、圖1。

表7 各組大鼠不同時點下丘腦中TGF-β1的表達Tab.7 Expression of TGF-β1 in hypothalamusin of each group in different

注:棕色為TGF-β1表達陽性。圖1 各組大鼠不同時點下丘腦組織中TGF-β1表達(HE,×400)Fig.1 Expression of TGF-β1 in hypothalamusin of each group in different periods(HE,×400)

2.5.2垂體中TGF-β1的表達 染氟4、5個月時,各染氟組大鼠垂體組織TGF-β1表達水平比較,差異具有統計學意義(P<0.05);與對照組比較,各染氟組大鼠染氟4個月時,垂體組織TGF-β1表達水平均低于對照組(P<0.05),而在第5個月,中、高氟組大鼠垂體組織TGF-β1表達水平低于對照組和低氟組(P<0.05)。見表8、圖2。

表8 各組大鼠不同時點垂體中TGF-β1表達Tab.8 Expression of TGF-β1 in pituitary of each group in different periods

注:棕色為TGF-β1表達陽性。圖2 各組大鼠不同時點垂體組織中TGF-β1表達(HE,×400)Fig.2 Expression of TGF-β1 in pituitary of each group in different periods(HE,×400)

2.5.3卵巢中TGF-β1的表達 3個時間點各染毒組卵巢組織中TGF-β1表達水平比較,差異均有統計學意義(P<0.05);與對照組比較,除第4個月低氟組大鼠卵巢組織中TGF-β1表達水平無統計學差異(P>0.05)、其余各組染氟及染氟時間點大鼠卵巢組織中TGF-β1表達水平均低于對照組,且低、中氟組隨染氟時間延長而降低(P<0.05)。見表9、圖3。

3 討論

本研究結果顯示,與對照組相比,不同氟劑量組均出現了不同程度的氟斑牙,且檢出率隨染毒劑量而增加,這與相關報道氟斑牙是氟中毒早期最常見的癥狀結果一致[16-17];同時,尿氟和骨氟作為機體代謝綜合作用結果,可反映近期氟的攝入量和體內的蓄積情況[18],本實驗中染毒組的尿氟、骨氟受劑量和時間影響,呈上升趨勢,說明雌性大鼠通過食物染氟方式導致氟在體內逐漸被代謝和蓄積結果。

表9 各組大鼠不同時點卵巢中TGF-β1的表達Tab.9 Expression of TGF-β1 in ovarian of each group in different

注:棕色為TGF-β1表達陽性。圖3 各組大鼠不同時點卵巢組織中TGF-β1表達(HE,×400)Fig.3 Expression of TGF-β1 in ovarian of each group in different periods(HE,×400)

在有關研究化學毒物對實質臟器的影響中,臟器系數能夠反映化學毒物對臟器的影響 ,也是尋找毒物作用靶器官的重要線索[19];臟器系數下降有可能是該實質器官發生萎縮、退行性改變;臟器系數升高 ,可考慮實質器官有充血、水腫、增生及肥大等變化的可能性。在本研究中,各染毒組雌性大鼠下丘腦、垂體組織臟器系數于各染毒時間段差異無統計學意義(P>0.05),但卵巢臟器系數于染毒第4個月、第5個月差異具有統計學意義(P<0.05),且中氟組、高氟組卵巢組織臟器系數高于對照組(P<0.05);這表明氟中毒可能對下丘腦、垂體臟器系數未產生明顯的影響,這與有關研究探索氟中毒對生殖系統影響結果相似[20-21];以上研究結果可能與所攝入氟通過血腦屏障含量有關,而且以往研究已經證實氟主要的蓄積部位是骨骼[22-23],因此氟可能進入其他靶器官的含量相比骨骼較少;并且已有研究表明,機體過多氟可通過血腦屏障蓄積在腦組織,從而誘發脂質過氧化導致腦細胞結構破壞[24]。因此出現以上結果有可能與血腦屏障特異性主動轉運有關,并且腦脊液的引流排泄作用也有可能將腦內多余的氟排出,從而維持腦內動態平衡[25]。故本研究中氟到達腦組織的量不會隨氟攝入量而增加,少量蓄積在腦內的氟對腦組織主要作用部位可能是大腦皮層,對接近間腦位置的下丘腦和位于垂體窩的垂體僅產生輕度的毒性作用,還不足以導致下丘腦、垂體出現顯的病理學改變;以上與周勇江[21]通過大鼠氟化鈉飲水方式染毒結果相似,說明慢性氟中毒主要影響雌性大鼠的卵巢組織,而對下丘腦和垂體組織影響不明顯。

TGF-β家族成員包括TGF-β1至TGF-β6,但在哺乳動物中僅發現TGF-β1至TGF-β3,其中,以TGF-β1的活性最強,數量最多,幾乎存在于所有細胞中。有關氟中毒非骨相研究中,韓學衛[26]發現氟作用下大鼠腎臟TGF-β1 表達顯著升高,TGF-β1可作為氟作用下腎臟損害主要檢測指標之一。在本研究中,不同染毒組下丘腦組織TGF-β1表達水平僅于第5個月差異具有統計學意義(P<0.05),并隨染毒劑量而增加,說明氟在持續染毒情況下才可刺激下丘腦組織中TGF-β1表達增強,以上與韓學衛得到結果相似。但在雌鼠垂體中TGF-β1表達中,我們觀察到染毒第4個月、第5個月,中氟組、高氟組雌鼠垂體中TGF-β1表達隨染毒時間呈低表達水平,且較對照組下降幅度大,在有關氟中毒研究結果提示對照組中出現了研究部位TGF-β1微表達[26],說明長時間氟暴露情況下氟對垂體組織中小分子活性物質表達的影響程度較正常情況下大。同時,有研究認為[27]TGF-β1能夠在卵巢組織中高度表達,參與卵泡發育、顆粒細胞的增殖、分化和排卵過程,本研究也觀察到TGF-β1在雌鼠卵巢中表達,但受氟劑量的影響呈低表達水平;有關研究提到:許多細胞因子既可影響下丘腦-垂體-卵巢軸激素的分泌,同時這些細胞因子的產生又可被這些激素調節[28];本研究中出現氟作用下雌鼠下丘腦、垂體、卵巢臟器中TGF-β1表達趨勢不同,這有可能與下丘腦-垂體-卵巢性腺軸雙向調節功能有關。同時,本研究中未觀察到下丘腦-垂體組織臟器系數有明顯影響,但出現了下丘腦-垂體TGF-β1表達異常,有可能是氟導致該部位組織中小分子活性因子出現異常,但尚未引起該部位組織形態及生理功能出現明顯變化。因此,本研究提示,氟作用于雌性大鼠后可影響下丘腦-垂體-卵巢性腺TGF-β1表達水平,且主要作用部位是卵巢組織。