高通量技術分析‘砂蜜豆’甜櫻桃不同組織內生細菌多樣性

趙柏霞， 閆建芳

（1.大連市農業科學研究院，遼寧 大連 116036； 2.大連民族大學生命科學學院，遼寧 大連 116600）

甜櫻桃（Prunus aviumL.）源于歐洲，因其果實具有鮮艷的色澤、較高的營養價值及上乘的口感備受消費者喜愛，且其果實發育期短、成熟期早、種植效益高，現已經在全世界范圍內廣泛栽植。近些年，甜櫻桃在中國也發展迅速，種植面積和產量都已經超過世界排名第一的土耳其，成為一些地區的支柱性產業[1]。

植物內生細菌存在于宿主植物組織[2]，且表現出多種生物活性，如促生長、抗旱、耐熱、抗病蟲害、拮抗病原體、溶磷、解鉀、固氮等[3-10]，還具有降解環境中污染物和生物修復的功能[11-12]。研究表明，植物內生細菌廣泛存在于多種糧食作物和水果、蔬菜及藥用植物中[13-16]，已報道的約有50多個屬，上百個種[17]。然而，對于甜櫻桃內生細菌方面的研究在國內外鮮有報道。

目前對于甜櫻桃內生菌的研究僅停留在分離培養和功能菌株篩選方面，張立新等[18]、郗良卿等[19]在‘紅燈’和‘美早’甜櫻桃果實中分離到了具有拮抗櫻桃病害的內生細菌。郭建偉等[20]在櫻桃樹皮、1年生枝條及葉片中分離到了21株內生細菌，其中8株具有拮抗流膠病能力，不同組織內生細菌的種群密度表現為樹皮（主干）＞葉＞枝（1年生）。但是，大部分內生菌為不可培養或難以培養，因此，通過傳統分離培養方法獲得的內生細菌具有較大的局限性，其試驗結果不能全面地反映植物內生細菌的群落組成。近年來，高通量測序技術發展突飛猛進，相比傳統的分離培養法，該技術具有通量高、速度快、準確性高等優勢，可以全面揭示供試微生物的種群結構和多樣性。目前，利用高通量測序技術對甜菜、蠶豆種子、棕櫚科種子等組織的內生細菌群落進行了研究[21-23]，揭示了內生細菌群落在不同物種、不同生長發育時期間都呈現出一定差異。

本試驗以‘砂蜜豆’甜櫻桃根、主干樹皮及1年生枝條為研究對象，采用高通量測序技術，分析大連地區‘砂蜜豆’甜櫻桃不同組織內生細菌物種組成、群落結構及多樣性的變化規律，旨在更加全面、準確地反映內生細菌在不同組織中的分布和差異，豐富和完善‘砂蜜豆’甜櫻桃內生菌資源，為進一步探討內生菌的抗逆、促生等生態功能提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

‘砂蜜豆’植株樣品采自遼寧省大連市農業 科 學研 究 院 甜 櫻桃 試 驗園（38°59′32″N，121°25′00″E），砧木為‘馬哈利’，樹齡7年。從每株上分別取根（SG）、枝條（SZ）和主干樹皮（SP）樣品，每3棵樹樣品均勻混樣后四分法作為1個重復，每個處理設5個生物學重復。

采集到的樣品放入無菌樣品袋中，帶回實驗室。先用自來水流水沖洗10 min，無菌濾紙吸干水分，用75%無水乙醇處理4 min，經無菌水洗滌后，用3%次氯酸鈉浸泡5 min，再用無菌水沖洗3~5遍，最后1遍無菌水洗滌液經涂板檢測無菌后，無菌條件下進行內生細菌DNA的提取。

1.2 總DNA提取及16S rRNA基因序列擴增

樣品總基因組DNA提取根據PowerSoil DNA分離試劑盒（MO BIO Laboratories）操作流程進行。選用通用引物338F和806R擴增16S rRNA V3~V4區，PCR擴增和后續分析在Illumina HiSeq 2500平臺（北京百邁客生物科技有限公司）上進行。

1.3 數據處理和統計分析

測序結束后，經過長度過濾、去除嵌合體得到優化序列，然后進行聚類，劃分操作分類單元(operational taxonomic unit，OTU)，相似性≥97% 的有效序列被聚為相同的OTU。根據OTU的序列組成與微生物參考數據庫進行比對，進行物種注釋及分類學分析。基于OTU結果，對樣品在各分類水平上進行分類學分析。通過Alpha多樣性研究單個樣品內部物種的多樣性，通過Beta多樣性來比較不同樣品間在物種多樣性方面存在的差異 。 采 用 PICRUSt（phylogenetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states）軟件進行功能和代謝途徑預測，將現有的16S rRNA基因測序數據與KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)數據庫對比，比較功能基因在生物代謝通路上的豐度差異，從而獲得‘砂蜜豆’甜櫻桃不同組織內生細菌群落功能預測信息[24]。

2 結果與分析

2.1 甜櫻桃不同組織內生細菌多樣性指數

從供試樣品中共獲得有效序列9 665 813條，每條序列平均長度401.07 bp。供試樣品Alpha多樣性指數如表1所示。根部樣品內生細菌的Shannon指數、Simpson指數、Chao1指數和ACE指數均高于主干樹皮和枝條，而主干樹皮和枝條樣品間無顯著差異。因此，大連地區‘砂蜜豆’甜櫻桃不同組織部位內生細菌以根部多樣性及豐富度最高，其他組織部位的多樣性及豐富度減少。

2.2 甜櫻桃不同組織內生細菌OTU 分布

在97%的序列相似度下，‘砂蜜豆’甜櫻桃3個組織部位的內生細菌共劃分為1 386個OTUs（圖1）。3個組織部位獲得的OTU 數量分別為1 302（SG）、1 301（SP）和1 229（SZ），各部位樣品中獲得的OTU數量差異不顯著；其中，共有OTU分別占各部位內生細菌OTU總量的86.3%、86.4%和91.5%，由此表明，3個組織樣品中共有的OTU占比較高，特有的OTU占比較少?！懊鄱埂饳烟也煌M織間特有的內生細菌群落組成有著較大差異，部分細菌種群表現出組織專一性。其中，根部內生細菌的特有OTU 數量最多，為36個；枝條和樹皮中分別為17和11個。除共有物種和特有物種外，不同組織間均有相同或相似物種。

圖1 甜櫻桃3個組織部位內生細菌OTU 水平韋恩圖Fig. 1 Venn of endophytic bacteria at OTU level in three tissues of sweet cherry

2.3 甜櫻桃不同組織部位細菌的組成和群落結構

‘砂蜜豆’甜櫻桃3個組織部位的樣品共檢測到20個門、43個綱、79個目、162個科和346個屬，不同組織中的各級細菌分類階層總數也存在差異，其中，根中的內生細菌種類最多；枝條次之；主干樹皮的內生細菌種類最少（表2）。

表2 ‘砂蜜豆’甜櫻桃不同組織內生細菌群落細菌學分類階層總數Table 2 Total numbers of bacterial taxa detected in different tissues of ‘Summit’

在門水平上，對于豐度高于0.1%的門進行統計（圖2），其中變形菌門（Proteobacteria）是‘砂蜜豆’甜櫻桃內生細菌的最優勢菌門，在SG、SP和SZ中的相對豐度分別為49.76%、60.34%和55.06%；其次是厚壁菌門（Firmicutes）（平均豐度18.49%）、擬桿菌門（Bacteroidetes）（平均豐度12.18%）及放線菌門（Actinobacteria）（平均豐度10.71%）。這4個菌門的相對豐度達95%以上。而不同組織部位內生細菌的組成比例也存在一定差異，放線菌門在SG中的相對豐度為22.61%，明顯高于SZ和SP（3.71%和5.81%）；厚壁菌門在SG中的相對豐度為13.96%，明顯低于SZ和SP（24.02%和17.49%）。從門水平上的物種組成可以看出，‘砂蜜豆’甜櫻桃不同組織間內生細菌的群落組成具有一定差異。

圖2 3個組織部位內生細菌門水平上物種組成Fig. 2 Abundance of endophytic bacteria at phylum level in three tissues of sweet cherry

在綱水平，α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）是3個組織部位內生細菌的優勢菌綱（圖3），但在不同組織部位中的相對豐度存在差異，其中，在SP中的相對豐度最高（43.14%）；在SZ中次之（39.04%）；在SG中最低（27.24%）。除α-變形菌綱外，放線菌綱在SG內生細菌中的相對豐度也較高，為20.26%，而在SP和SZ中的相對豐度則較低，分別為4.14%和2.79%。

圖3 3個組織部位內生細菌綱水平上物種組成Fig. 3 Abundance of endophytic bacteria at class level in three tissues of sweet cherry

在屬水平上，供試樣品中未知種類菌屬的相對豐度最高（圖4）。在SG中，除未知菌屬外，鏈霉菌屬（Streptomyces）的相對豐度較高，為6.10%；其次為類固醇桿菌屬（Steroidobacter）（5.62%）和乳酸桿菌屬（Lactobacillus）（4.67%）。在SZ中，鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）的相對豐度較高，為7.71%，但其在SP和SG中的相對豐度較低，分別為3.13%和2.76%。在SP中，擬桿菌屬（Bacteroides）的相對豐度較高。

圖4 3個組織部位內生細菌屬水平上物種組成Fig. 4 Abundance of endophytic bacteria at genus level in three tissues of sweet cherry

2.4 甜櫻桃不同組織內生細菌差異分析

為進一步探究甜櫻桃不同組織內生細菌的差異，對供試樣品進行了LEfSe（line discriminant analysis effect size）分析，在SG中，具有顯著差異的菌門是變形菌門和放線菌門；在SZ中，具有顯著差異的菌門為厚壁菌門；在SP中，具有顯著差異的菌門為變形菌門（圖5）。由此表明，甜櫻桃不同組織部位內生細菌的菌群存在顯著差異，以根部內生細菌最為豐富。

圖5 各樣品細菌差異LEfSe 分析圖Fig. 5 Bacterial taxa significantly differentiate responding to the different tissues using LEfSe

設定LDA（line discriminant analysis）值＞4條件下，SG內生細菌有30個差異顯著單元；SZ的差異顯著單元為7個；SP的差異顯著單元最少，僅2個（表3）。SG內生細菌差異顯著單元中有19個分布在變形菌門，其中黃單胞菌目（Xanthomonadales）9個，根瘤菌目（Rhizobiales）3個，鞘脂單胞菌目（Sphingomonadales）3個，紅螺菌目（Rhodospirillales）2個，粘球菌目（Myxococcales）1個；11個分布在放線菌門，其中鏈孢囊菌目 (Streptosporangiales) 3個，小單孢菌目(Micromonosporales) 3個，鏈霉菌目(Streptomycetales) 3個。SZ內生細菌的7個差異顯著單元中6個分布在厚壁菌門，1個為擬桿菌門，其中厚壁菌門中4個屬于乳酸桿菌目（Lactobacillales），另2個屬于腸球菌科（Enterococcaceae）。SP內生細菌的2個差異顯著單元均為變形菌門的根瘤菌目（Rhizobiales）。

表3 LEfSe統計檢驗結果Table 3 Results of LEfSe statistical test

表3 LEfSe統計檢驗結果Table 3 Results of LEfSe statistical test 續表 Continued

表3 LEfSe統計檢驗結果Table 3 Results of LEfSe statistical test 續表 Continued

2.5 3個組織部位內生細菌群體聚類分析

采用非度量多維標定法（non-metric multidimensional Scaling，NMDS）比較甜櫻桃3個不同組織部位樣本間群落結構的相似性，如圖6所示。NMDS1把SG、SP和SZ分成不同的組。SP組樣品中的2個樣品點有些偏離，沒有聚到SP組，這說明取樣時具有一定的誤差，但是該圖的脅強系數為0.137 6（＜0.2），說明該分析具有一定的可靠性，可以解釋樣品中所含內生細菌的真實情況。由此表明，‘砂蜜豆’甜櫻桃根部組織內生細菌與主干樹皮和枝條部位的內生細菌存在明顯差異，而主干樹皮的內生細菌群落與枝條的內生細菌群落更為相近。

圖6 甜櫻桃內生細菌的NMDS二維排序圖Fig. 6 Two-dimensional sorting map of endophytic bacteria in sweet cherry by NMDS analysis

2.6 不同組織甜櫻桃內生細菌功能基因預測

采用PICRUSt 軟件預測內生細菌的功能基因，所有基因序列注釋的功能可以分為6大類，主要涉及新陳代謝、遺傳信息處理、環境信息處理、人類疾病、細胞過程及有機系統。其中，新陳代謝相關基因的數量最多，占總數的73.45%~75.18%，主要包括碳水化合物、氨基酸、能量、輔酶因子和維生素、類脂物代謝等。環境信息處理相關基因的數量占總基因數的8.0%~9.83%，主要涉及膜運輸和信號傳導。遺傳信息處理相關基因的數量占總基因數的8.35%~9.04%，主要為復制、修復機制及翻譯機制。

3 討論

本文利用高通量測序技術分析了‘砂蜜豆’甜櫻桃內生細菌的群落特征及不同組織部位間的差異，結果表明，‘砂蜜豆’甜櫻桃不同組織的內生細菌具有豐富的多樣性，且不同組織部位中的群落結構存在差異，其中根部內生細菌的多樣性以及豐富度最高，且特有OTU數量也較多；主干樹皮和枝條部位的多樣性及豐富度較低。內生菌是由土壤、空氣中微生物入侵宿主，然后與宿主協同進化而來，這些因素共同造成了內生細菌分布的專一性。變形菌門（Proteobacteria）是3個組織部位內生細菌的最優勢菌門，在根部、主干樹皮、枝條中的相對豐度分別為49.76%、60.34%和55.06%。變形菌門在植物體內廣泛分布，其物種和遺傳多樣性極為豐富，已應用于植物病蟲害防治、土壤修復、生物固氮等方面[25-27]。厚壁菌門、擬桿菌門和放線菌門在3個組織中相對豐度也較高，其中放線菌門在根中相對豐度明顯高于在其他部位，而厚壁菌門在根部的相對豐度較低。芽孢桿菌是厚壁菌門中一類在自然界中分布廣泛的革蘭氏陽性化能異養菌，在水產養殖、發酵飼料添加劑以及植物病蟲害生物防治方面應用較多[28-29]。放線菌門細菌是一類非常重要的生防微生物，可以在生長過程中產生大量且種類繁多的抗生素[30]。

在屬水平上，未分類細菌的相對豐度最高，這說明甜櫻桃中含有豐富的未知種類細菌。除未知細菌外，在根部樣品中，鏈霉菌屬的相對豐度最高；在枝條樣品中，鞘氨醇單胞菌屬的相對豐度最高；在主干樹皮樣品中，擬桿菌屬和鞘氨醇單胞菌屬的相對豐度較高。鏈霉菌、鞘氨醇單胞菌、乳酸桿菌及芽孢桿菌在‘砂蜜豆’甜櫻桃各組織中的相對豐度均較高，這可能是由于他們均具有抗逆、促生等性能，可促進甜櫻桃的生長和防治病蟲害。菌群豐度變化為挖掘甜櫻桃具有特定應用價值的微生物種資源指明了方向。研究表明，鏈霉菌屬在細菌界中不僅數量最多，而且也是產生生物活性物質種類最多的一類細菌[31]，該屬的功能主要有分泌多種具促生長和拮抗病原菌的代謝物、增強植物抗逆性、改善土壤結構等[32]。近年來，各國學者不斷研究挖掘新的天然生物活性物質，鞘氨醇單胞菌是報道較多的一種重要微生物資源，它能夠合成生物聚合物、降解芳香族化合物，在環境生物領域顯現出巨大潛力[33-34]；芽孢桿菌具有產生生長素、解磷、解鉀、固氮及抗菌等功能[35]；乳酸桿菌則具有拮抗病原菌、降解污染物等功能[36-37]。此外，在不同組織中還含有大量未知種屬的微生物類群，這些未知微生物類群為挖掘在促生、抗逆、土壤修復、環境、醫藥等方面有重要應用價值的新有益微生物資源提供了廣闊發展空間。

研究發現，植物內生細菌群落變化動態受多方面因素的影響，包括宿主植物種類[38-39]、宿主植物生長發育階段[16,40]、地理位置及宿主植物組織器官[41]等。本研究通過NMDS分析表明，‘砂蜜豆’甜櫻桃組織器官類型影響內生細菌的群落組成，主干樹皮和枝條部位內生細菌的群落結構更為相近，而根部組織內生細菌與其他2個部位的內生細菌群落結構則具有明顯差異。這與郭建偉等[20]研究結果一致，表明甜櫻桃組織部位是影響其內生細菌種群結構與多樣性變化的因素之一。

PICRUSt基因功能預測分析表明，甜櫻桃內生細菌中與新陳代謝相關的功能基因相對豐度最高，在其生長過程中發揮著重要作用。由于甜櫻桃果實中含有豐富的糖類、有機酸、維生素和微量元素[42]，因此，其內生細菌基因功能涉及氨基酸類、脂類、多糖、維生素、萜類、酮類及其他次生代謝產物合成等有關通路。這說明甜櫻桃內生細菌可能參與甜櫻桃中各種營養物質的代謝，為植株生長發育提供必需的養分[43]。因此，通過獲得不同組織中內生細菌與甜櫻桃中有效化學成分合成的相關信息，為協調甜櫻桃中營養成分的生物合成和運輸分解、充分挖掘甜櫻桃的內生細菌資源、提升其果實品質提供參考依據。根部組織中調控各種代謝的內生細菌物種的相對豐度較高，這與群落多樣性研究結果一致。

此外，本研究表明，‘砂蜜豆’甜櫻桃不同組織部位內生細菌的群落構成有著較大差別，同時又有著一定的共性，各組織內均存在大量的未知菌種，這給微生物資源挖掘和差異基因的功能分析提供了新的資源和線索，值得進一步深入研究。后續研究將在本研究基礎上，通過改良菌株培養基成分、培養方法等手段，盡可能多的分離出這些內生細菌菌株，對其進行功能評價，發掘和篩選在促生效應、病蟲害生物防治以及環境治理等方面具有較大應用潛力的微生物菌株。