FATP1對山羊肌內脂肪細胞的促進作用

李琪，楊昌恒，王永，林亞秋,，向華，朱江江,

對山羊肌內脂肪細胞的促進作用

李琪1，楊昌恒1，王永1，林亞秋1,2，向華2，朱江江1,2

1青藏高原動物遺傳資源保護與利用四川省重點實驗室/西南民族大學，成都 610041；2青藏高原動物遺傳資源保護與利用教育部重點實驗室/西南民族大學，成都 610041

【背景】脂肪酸轉運蛋白1（FATP1）能夠促進哺乳動物脂肪酸攝取，該過程對維持機體脂代謝平衡十分重要，也對家畜的肉質好壞有著重要影響。【目的】通過獲得山羊的CDS區序列，檢測該基因在山羊不同組織中的表達量，探究其對山羊肌內脂肪細胞脂質代謝的影響，為進一步揭示在山羊脂代謝中的作用機制提供參考，為山羊的遺傳育種改良提供理論依據。【方法】利用RT-PCR方法克隆獲得山羊的CDS區序列，利用在線工具分析其親疏水性、跨膜區域、信號肽等生物學特性，并構建其氨基酸序列系統進化樹。利用實時熒光定量PCR（RT-qPCR）技術檢測在山羊不同組織中的表達水平，構建其組織表達譜。利用構建的真核表達載體和篩選出的siRNA對山羊肌內脂肪細胞進行FATP1過表達和干擾處理，通過油紅O染色和甘油三酯測定檢測過表達和干擾后對山羊肌內脂肪細胞脂質沉積的影響，并通過RT-qPCR技術進一步探究該基因過表達和干擾后對脂質代謝相關基因表達的影響。【結果】克隆獲得了CDS區1 941bp，共編碼646個氨基酸殘基，預測其分子式為C3196H5026N884O898S25，推測該蛋白為堿性疏水穩定蛋白。三級結構預測顯示，山羊與綿羊的FATP1蛋白質三級結構相似，而與牛的FATP1蛋白質三級結構略有不同。氨基酸序列系統進化樹分析顯示，山羊FATP1與綿羊親緣關系最近。RT-qPCR檢測發現在山羊小腸中表達量最高。油紅O染色及甘油三酯測定表明過表達FATP1后山羊肌內脂肪細胞內脂滴數量增多，脂質含量增加，而干擾FATP1后則得到了相反的結果。進一步檢測脂質代謝相關基因的表達變化，發現在山羊脂肪細胞中過表達后，脂肪酸合成、轉運等相關基因（＜0.01）、（＜0.01）、（＜0.01）、（＜0.01）、（＜0.01）、（＜0.01）及（＜0.05）的表達水平顯著升高，而脂解相關基因（＜0.01）的表達水平則顯著降低；干擾后，脂肪酸轉運、延長等相關基因（＜0.01）（＜0.01）和（＜0.05）的表達量顯著下降，脂解相關基因（＜0.01）和（＜0.05）的表達量顯著上升。【結論】FATP1可能通過促進細胞脂質生成相關基因的表達，降低脂質降解相關基因的表達，從而顯著促進山羊肌內脂肪細胞脂質的沉積，這些結果為進一步揭示在調控脂質代謝中的作用及分子機制提供了試驗參考。

山羊；脂肪酸轉運蛋白1；肌內脂肪細胞；脂質沉積

0 引言

【研究意義】哺乳動物體內的脂質積累已經被廣泛研究了幾十年，它與人類的肥胖和家畜的肉類品質有著重要的聯系[1-3]。尤其是肌內脂肪的含量對肉質影響極為重要，會直接影響肉色、嫩度、風味[4]等方面。而脂肪細胞是機體脂質儲存的主要部位[5]，細胞對脂肪酸的攝取主要是由蛋白質介導的，有幾個蛋白質家族參與了這一過程，其中一個家族是脂肪酸轉運蛋白家族（fatty acid transport proteins, FATPs）。FATPs是一類參與脂肪酸吸收和活化的重要蛋白質，目前在哺乳動物基因組中共發現了6個成員，FATP1—6[6-7]。這6種已經鑒定的FATPs的表達具有組織特異性[8]，在維持機體的脂肪酸（FAs）穩態中發揮重要作用。簡州大耳羊是我國培育的第二個肉用山羊品種，影響羊肉品質的因素較多，如遺傳因素，營養因素，飼養環境等，而基因調控是肉質調控的重要方式，有關脂質代謝的相關基因的克隆、功能分析、生物學特性方面的研究可以提升羊肉品質，為山羊遺傳特性的改良提供理論依據。【前人研究進展】FATP1是第一個被鑒定的該家族成員，在脂肪細胞中最具特征[9]。FATP1也稱為溶質載體家族27成員1（SLC27A1），由Schaffer和Lodish[10]從3T3-L1脂肪細胞cDNA表達文庫中鑒定和克隆。FATP1是一種進化上保守的膜蛋白[11]，在蛋白質的氨基末端區域有一個跨膜結構域[12]，該蛋白質主要定位于細胞質膜[10]和內質網[13]，對動物的脂肪沉積具有調控作用[14-15]。哺乳動物FATP1最初被確定為一種脂肪酸轉運體[11]。然而，隨后研究發現FATP1具有酰基輔酶A合成酶活性[16-18]，與超長鏈輔酶A合成酶家族具有廣泛的氨基酸相似性[16]，其表達與脂肪酸攝取之間存在良好的相關性[19-20]，能夠促進哺乳動物脂肪酸攝取[21-23]。研究表明。過表達FATP1可以增加脂肪細胞的FAs輸入，促進三酰甘油的合成[21,24-25]，而脂肪酸氧化則會受到干擾，略有減少[26]，而FATP1表達的降低能夠顯著降低小鼠脂肪組織中FAs的攝取量[27]。【本研究切入點】盡管FATP1與脂肪酸代謝有關的研究越來越多，但關于FATP1調控山羊脂肪細胞內脂質代謝的研究還未見報道。本試驗利用RT-PCR方法克隆獲得山羊，利用實時熒光定量PCR技術（RT-qPCR）檢測該基因在山羊不同組織中的表達量，利用油紅O染色觀察干擾或過表達FATP1對山羊脂肪細胞脂質代謝的影響，并利用RT-qPCR檢測脂質代謝相關基因的表達變化。【擬解決的關鍵問題】這些結果將為進一步研究FATP1調控山羊肌內脂肪細胞脂質代謝機制提供重要的數據支持，為山羊遺傳特性的改良提供基礎理論。

1 材料與方法

所有試驗均于2020年9月至2021年10月在西南民族大學青藏高原動物遺傳資源保護與利用四川省重點實驗室完成。

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗取材 隨機選取6只成年（1周歲）健康的雄性簡州大耳羊為試驗動物（購自四川省簡陽市大哥大牧業有限公司）。屠宰后采集其心、肝、脾、肺、腎、大腸、小腸、瘤胃等組織樣品，將采集的各組織分割成黃豆大小，用DEPC水清洗干凈后迅速裝入無RNase的凍存管中，置于液氮中保存，用于后續組織RNA的提取。

1.1.2 試驗試劑 DNA回收試劑盒、大腸桿菌DH5α感受態細胞購自天根生化科技有限公司，DNA聚合酶、TRIzol、pMD-19T Vector、限制性內切酶購自寶（TaKaRa）生物公司，SYBR qPCR Master Mix試劑盒、反轉錄試劑盒購自南京諾維贊公司。DMEM/F-12培養基、Opti-MEM、PBS緩沖液 pH7.4購自賽默飛世爾生物化學制品有限公司；BCA 總蛋白質定量試劑盒，胰蛋白酶，青霉素-鏈霉素購自武漢博士德（Boster）生物工程有限公司；細胞/組織甘油三酯提取試劑盒購自北京普利萊（Applygen）基因技術有限公司；其他實驗室常規藥品及試劑均為國產。

1.2 試驗方法

1.2.1 組織總RNA提取及反轉錄 用Trizol法提取簡州大耳羊的心、肝、脾、肺、腎、瘤胃等組織的總RNA，測定總RNA的OD260/OD280值，當該值在 1. 8—2. 0 之間說明可正常使用，然后通過瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。利用反轉錄試劑盒將提取的RNA反轉錄合成cDNA，反應體系及條件：總RNA 1 μg，4×gDNA wiper Mix 4 μL，加 RNase-free ddH2O水至16 μL，42℃ 2 min；然后加入5×HiScript Ⅲ qRT SuperMix 4 μL，37℃ 15 min，85℃ 5 s。-20℃保存。

1.2.2 山羊克隆 根據GenBank上山羊的（XM_018051382.1）預測序列，利用Primer Premier 5.0軟件設計PCR引物（表1）。RT-PCR反應總體系：LA Taq 0.2 μL，dNTP Mix 3.2 μL，10×Buffer 2 μL，上下游引物（10 μmol·L-1）各1μL，模板cDNA 1μL，加水補至20 μL。利用Touchdown PCR方法進行克隆，Touchdown PCR擴增程序：94℃預變性3 min；94℃變性15 s，64℃/66 ℃退火30 s，72℃延伸2 min，每個循環降低0.5℃，20個循環；94℃變性15 s，55℃/56℃退火30 s，72℃延伸2 min，15個循環；72℃延伸10 min，4 ℃保存。1%的瓊脂糖凝膠檢測PCR產物后利用膠回收試劑盒對目的片段進行回收純化，將回收產物連接到pMD-19T載體上，通過熱激轉化到感受態細胞（DH5α）中，然后接種于涂有IPTG和X-gal的LB固體培養基（含Amp）上，37℃過夜培養后挑取白色陽性菌落，進行菌液PCR鑒定后送至成都擎科生物技術有限公司進行測序。

表1 FATP1的CDS區克隆引物

1.2.3 山羊生物學特性分析 使用Bioxm 2.6軟件對測序獲得的序列進行開放閱讀框預測，并將其翻譯為氨基酸序列；使用ProtParam在線工具對翻譯后所得FATP1蛋白序列進行分子量、等電點、酸堿性等理化性質分析；使用Prot Scale（http://web.expasy.org/protscale）預測蛋白親疏水性；利用ExPASy（https://embnet.vital-it.ch/software/ TMPRED_form.html）預測蛋白跨膜區域；利用EMBL-EBI（https://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/phobius/）及TargetP-2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP- 2.0/）進行蛋白信號肽的預測。使用SOPMA分析該蛋白的二級結構，通過SWISS-MODEL預測蛋白三級結構，利用STRING構建蛋白互作網絡，預測與其發生相互作用的蛋白；使用 MEGA 5.0 軟件采用鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）構建氨基酸系統進化樹。

1.2.4 山羊組織表達差異分析 根據克隆獲得的序列設計其RT-qPCR引物（表2）。利用RT-qPCR技術檢測在各個組織中的表達差異，以山羊心臟組織的Ct值為對照，以為內參基因[28-29]矯正目的基因的相對表達水平，每個組織樣本設置3個重復。

1.2.5 山羊肌內脂肪細胞培養 利用實驗室前期分離凍存于10% DMSO冷凍液中[30]的兩日齡山羊肌內前體脂肪細胞，于37℃融化復蘇，培養于含有 10%胎牛血清DMEM 完全培養液中。細胞培養到約80%匯合，細胞出現接觸抑制后，接種于6孔板，繼續培養，直到細胞用于試驗操作。

1.2.6 山羊亞克隆及過表達載體構建 根據1.2.2克隆獲得的山羊CDS 區序列，在引物上游加上保護堿基、d Ⅲ 酶切位點、Kozak序列和Flag標簽蛋白序列；下游加上H Ⅰ 酶切位點，引物序列見表1。將試驗獲得的pMD19-T-質粒作為模板，利用以上引物進行擴增。對PCR目的產物切膠回收后，進行酶切，于16℃連接至真核表達載體pcDNA3.1上。轉化至感受態細胞DH5α，經菌液PCR鑒定后，提取質粒進行雙酶切鑒定，然后送至成都擎科生物有限公司進行測序鑒定，鑒定成功即可獲得過表達載體pcDNA3.1-。

1.2.7 干擾siRNA合成 以克隆獲得的CDS區序列為模板，由上海吉瑪制藥技術有限公司合成3條山羊siRNA，序列信息見表3。

1.2.8 細胞轉染 過表達載體或siRNA轉染至覆蓋皿底達80%的F3代山羊肌內前體脂肪細胞，完全培養液在轉染的4h之前棄掉，加入Opti-MEM進行細胞饑餓處理4h后，在6孔板中每孔分別加入1 μg重組載體或2 μL siRNA，混勻后置于37℃、5% CO2培養箱，6 h后棄掉轉染液，PBS清洗3遍，每孔加入2.5 mL油酸（50 μmol·L-1）誘導液進行誘導分化。

1.2.9 油紅O染色檢測FATP1對脂滴生成的影響 利用油紅O染色法觀察過表達或干擾后山羊肌內脂肪細胞分化過程中脂滴積聚的變化。用于染色的肌內脂肪細胞接種于6孔板，轉染2 d后棄去培養基，用PBS緩慢清洗3次，甲醛固定30 min，棄去甲醛，PBS清洗3次后加入適量過濾后的油紅O工作液，染色20 min，棄去油紅O工作液后用PBS清洗多次，顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.10 甘油三酯測定 用PBS清洗待測的細胞2—3遍，每孔加入200 mL裂解液，吹打收集細胞于離心管中，混勻后室溫靜置10 min。取適量上清液70℃加熱10 min，室溫2 000 r/min離心5 min，上清液即可用于甘油三酯測定。按R1﹕R2=4﹕1的比例配制工作液，96孔板每孔加入10 μL待測樣品和190 μL工作液，同時稀釋甘油標準品，將4 mmol·L-1的甘油標準品用蒸餾水按比例稀釋為1 000、500、125、31.25、7.8125、0 μmol·L-1，每個樣品設置3個重復，37℃或者25℃反應15 min，550 nm波長測定OD值，繪制標準曲線并計算各樣品甘油三酯濃度。

剩余裂解液采用BCA法進行蛋白定量。按試劑A﹕試劑B=50﹕1配制BCA工作液，并充分混勻。將濃度為2 mg·mL-1的BSA標準品按比例稀釋為2 000、1 500、750、250、25、0 μg·mL-1各取25 μL標準品和待測樣品加入96孔板中，每孔加入200 μLBCA工作液，每個樣品設置3個重復，振蕩30 s充分混勻，37℃孵育30 min。冷卻到室溫后，在酶標儀上的562 nm波長檢測吸光值，繪制蛋白標曲并計算各樣品蛋白濃度。利用計算所得的各樣品蛋白濃度來對各樣品甘油三酯濃度進行校準。

1.2.11 實時熒光定量PCR（RT-qPCR） 為進一步探究FATP1在脂質代謝中的作用機制，將其過表達及干擾后，檢測對脂肪酸延長相關基因（，，，，和）、脂肪酸轉運相關基因（，和）、甘油三酯合成相關基因（，，，和）和脂肪分解相關基因（，，，和）表達的影響。引物序列見表2。

表2 定量引物

S：正義鏈引物；A：反義鏈引物；：泛表達轉錄子基因 S: Sense primer; A: Antisense primer;: Ubiquitously expressed transcript

表3 siRNA序列

1.2.12 數據分析 RT-qPCR結果用2?△△Ct法進行統計分析，采用SPSS軟件單因素方差分析法進行差異顯著性分析，選擇LSD方法和鄧肯法進行事后比較，＜0.05時為差異顯著，＜0.01時為差異極顯著，所有試驗數據設置至少3個重復，利用GraphPad Prism 5進行統計分析作圖。

2 結果

2.1 山羊FATP1克隆

將反轉錄的山羊各組織cDNA混合后作為模板，RT-PCR擴增獲得山羊序列2 07 8bp（圖1），其中5′UTR 112 bp，CDS區1 941 bp，3′UTR 25 bp，編碼646個氨基酸殘基。

圖1 山羊FATP1 PCR擴增

2.2 山羊FATP1生物學特性分析

2.2.1 蛋白理化性質分析 對山羊FATP1蛋白序列進行分析，預測其蛋白分子式為C3196H5026N884O898S25，分子質量為71 003.95 Da；理論等電點（Theoretical pI）為8.83，不穩定指數為34.85，親水性總平均值為0.044，推測該蛋白為堿性疏水穩定蛋白。該氨基酸組成中，亮氨酸（Leu）是占比最多的氨基酸殘基（12.2%），其次為甘氨酸（Gly）（10.4%）（圖2）。TargetP-2.0 預測FATP1信號肽可能性為0.9552。

A：FATP1蛋白親疏水性預測。B：FATP1蛋白跨膜結構預測。C：FATP1蛋白信號肽預測

2.2.2 蛋白質結構預測 山羊FATP1二級結構預測顯示，227（35.14%）個氨基酸殘基可能形成 α-螺旋（h），146（22.60%）個氨基酸殘基可能形成β-折疊(e)，219（33.90%）個氨基酸殘基可能形成無規則卷曲（c），54（8.36%）個氨基酸殘基可能形成β-轉角（t）（圖3-A）。三級結構預測顯示，山羊與綿羊的FATP1蛋白質三級結構相似，而與牛的FATP1蛋白質三級結構略有不同（圖4）。采用 STRING 交互式數據庫搜索可能與FATP1蛋白各成員相互作用的蛋白，結果如圖3-B。

2.2.3 氨基酸序列同源性比對及系統進化樹構建 利用NCBI對不同物種FATP1的氨基酸同源性進行比較，發現山羊與綿羊的氨基酸序列同源性最高（99.38%），其次為牛（98.45%）和豬（93.96%），而與人的同源性為92.26%。利用MAGE 5.0構建山羊FATP1氨基酸序列系統進化樹，結果如圖所示（圖3-C）。

A：FATP1蛋白質二級結構預測（藍色線條為α-螺旋，紅色線條為β-折疊，紫色線條為無規則卷曲，綠色線條為β-轉角）；B：FATP1相互作用蛋白預測；C：FATP1氨基酸序列系統進化樹

A：山羊FATP1蛋白三級結構；B：綿羊FATP1蛋白三級結構；C：牛FATP1蛋白三級結構

2.3 山羊FATP1基因組織表達差異分析

以山羊心臟組織為對照，為內參基因，分析RT-qPCR定量結果可知在山羊各組織中均有表達，其中在山羊小腸組織中高表達（＜0.01，圖5-A）。

2.4 過表達載體構建成功及siRNA干擾效率檢測

使用d Ⅲ和H Ⅰ限制性內切酶對pcDNA3.1-重組質粒進行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳分別得到長度約為5 428 bp的pcDNA3.1載體片段和2 040 bp 的目的基因片段（圖5-B），測序結果顯示，插入序列與目的基因序列完全一致，證明表達載體pcDNA3.1-構建成功。采用qPCR技術檢測FATP1過表達及siRNA干擾后FATP1的表達情況，以UXT作為內參基因，陰性對照組表達水平作為參照，結果顯示，轉染了pcDNA3.1-后FATP1的表達水平提高了約230倍（圖5-C），合成的siRNA對FATP1的表達水平均有干擾效果，其中FATP1-1的干擾效果最佳，達到約74%（圖5-D），故后續干擾試驗采用FATP1-1。

2.5 過表達FATP1促進肌內脂肪細胞脂質沉積

FATP1過表達后能夠顯著增加山羊肌內前體脂肪細胞脂滴的形成（圖6-A—C）（＜0.01）和甘油三酯沉積（圖6-D）（＜0.01）。同時FATP1表達水平的增加還能夠顯著提高甘油三酯合成相關基因（＜0.01）、（＜0.01）和（＜0.01）（圖6-E），脂肪酸去飽和及延長相關基因（＜0.01）、（＜0.01）和（＜0.05）（圖6-F），以及脂肪酸轉運相關基因（＜0.01）（圖6-H）的表達量，而顯著降低脂解相關基因（＜0.01）的表達（圖6-G）。推測，FATP1能夠通過促進甘油三酯的合成及脂質的延長和轉運，抑制脂質分解，從而促進山羊肌內前體脂肪細胞脂質的沉積。

A：重組質粒 pcDNA3.1-FATP1酶切鑒定（泳道1為Marker DL5000，泳道2為pcDNA3.1，泳道3為重組質粒pcDNA3.1-FATP1，泳道4為Marker Ⅲ）。 B：山羊FATP1在不同組織中的表達水平（差異顯著（P＜0.05）用不同小寫字母表示；差異極顯著（P＜0.01）用不同大寫字母表示；差異不顯著（P>0.05）用相同字母表示）。C：FATP1在細胞中的過表達效率。D：FATP1在細胞中的干擾效率（*表示在0.05 水平上顯著， **表示在0.01水平顯著，***表示在0.001水平上顯著）

A和B：對照組（pcDNA3.1）及過表達組（FATP1 OVER）細胞油紅O染色；C：油紅O染色OD值檢測（490nm）；D：細胞甘油三酯含量測定；E：甘油三酯合成相關基因檢測；F：脂肪酸去飽和及延長相關基因檢測；G：脂肪酸降解相關基因檢測；H：脂肪酸轉運相關基因檢測

2.6 干擾FATP1基因抑制肌內脂肪細胞脂質積累

FATP1干擾后顯著減少了山羊肌內前體脂肪細胞中脂滴的形成（圖7-A—C）（＜0.01）和甘油三酯的生成（圖7-D）（＜0.01）。同時FATP1表達水平的降低也顯著地減少了脂肪酸去飽和及延長相關基因（＜0.01）和（＜0.05）（圖7-E），脂肪酸轉運相關基因（＜0.01）（圖7-F）的表達量，甘油三酯合成相關基因GPAM（=0.069）和DGAT2（=0.065）的表達量也有所下降，但其變化不顯著（圖7-G），而脂肪分解相關基因（＜0.01）和（＜0.05）的表達水平顯著升高（圖7-H）。推測，干擾FATP1能夠通過抑制脂肪酸的延長和轉運，增加脂質降解來抑制山羊脂肪細胞中脂質的沉積。

A和B：對照組（si-NC）及干擾組（FATP1-1）細胞油紅O染色；C：油紅O染色OD值檢測（490nm）；D：細胞甘油三酯含量測定；E：脂肪酸去飽和及延長相關基因檢測；F：脂肪酸轉運相關基因檢測；G：甘油三酯合成相關基因檢測；H：脂肪酸降解相關基因檢測

3 討論

3.1 FATP1促進山羊肌內脂肪細胞脂質沉積

FATP1首次在3T3-L1脂肪細胞中被鑒定為定位于質膜的完整膜蛋白[10]，其質膜定位后續在293細胞[31]和棕色脂肪組織[32]中也被鑒定到。FATP1通過其膜定位參與FAs轉運，進而調控甘油三酯合成和脂質沉積[14,33]。過表達FATP1可提高FAs的轉運率，增加FAs的攝取，抑制FAs的氧化，最終促進酵母菌株[34]、293細胞[31]、人肌肉細胞[26]和豬肌內前體脂肪細胞的脂質積累[14]。而降低FATP1的表達則能夠引起3T3-L1脂肪細胞甘油三酯積累減少和脂滴減小[35]。在本研究中，干擾山羊脂肪細胞FATP1后，雖然對甘油三酯合成的相關基因的表達水平沒有顯著影響，但是脂質降解基因表達水平顯著升高，細胞中甘油三酯含量和脂滴的數量都有所減少。而在過表達FATP1后，細胞內脂質含量及促進脂質合成基因的表達水平都有所提高。推測，FATP1可能通過促進脂質沉積相關基因的合成和抑制脂解相關基因的表達，從而促進山羊肌內脂肪細胞脂質沉積。

3.2 FATP1功能具有兩面性

然而，隨著研究的不斷深入，對FATP1的功能也開始逐漸有了爭議。雖然有許多研究表明FATP1可促進脂質積累，但也有研究者得到了相反的結果[11,36]。脂肪組織是一個典型的脂質儲存庫，FATP1能夠增強其脂質的積累。相反，肌肉收縮需要持續消耗能量，FATP1則促進FAs氧化以提供能量。在大鼠L6E6肌管[37]、心肌細胞[38-39]和肌肉組織[11]中，FATP1主要定位于線粒體，從而介導了這些組織中FAs的氧化[40]。在肌肉組織中FATP1的線粒體定位與FATP1的FAs氧化作用相關。在培養的肌肉細胞和小鼠肌肉組織中，FATP1過表達則以促進脂肪酸氧化而非甘油三酯積累為目標[11,41]。FATP1功能的兩面性可能與其不同的組織及亞細胞定位相關。

3.3 FATP1是重要的脂質代謝調控因子

FATP1對脂質代謝的影響受PPAR[42-43]、TR4[44]、 KLF15[45-47]等轉錄因子的調節。TR4可直接結合位于FATP1 5′啟動子區域的TR4響應元件來反式激活FATP1 5′啟動子活性，從而誘導FATP1基因的表達，促進3T3-L1脂肪細胞中的脂質積累[44]。此外，脂滴相關基因也會影響FATP1對脂代謝的調控。脂滴是中性脂質儲存和動員的關鍵位點[48]。FATP1能與DGAT2形成甘油三酯合成復合物[49]，作用于ER–LD界面，作用促進哺乳動物細胞中脂滴的擴增，從而影響機體脂代謝。本試驗中通過過表達和干擾試驗來探究在調控山羊肌內前體脂肪細胞脂質沉積中的作用，這也為后續從轉錄因子等上游調節因子的角度完善胞內脂質代謝的調控網絡奠定了基礎。FATP1在脂肪和肌肉組織中都能夠起到調節脂質代謝的作用，由此可見FATP1在機體脂代謝中的重要性。無論是FATP1完整的調控網絡的挖掘還是其既能促進脂質積累也和脂肪酸氧化相關的獨特性功能，都需要更進一步的研究來闡明，從而更充分地把握該基因的作用機制，并將其對脂質代謝的調控作用運用到山羊及更多家畜的優良品種選育中。

4 結論

克隆獲得山羊的CDS區全長1 941 bp，編碼646個氨基酸殘基，在山羊小腸組織中高表達。FATP1可能通過促進脂質生成、抑制脂質分解和脂肪酸氧化，進而促進山羊肌內脂肪細胞脂質沉積。這些結果能為進一步揭示在脂質代謝中的作用及其調控機制提供理論基礎。

[1] STEFAN N, SCHICK F, H?RING H U. Causes, characteristics, and consequences of metabolically unhealthy normal weight in humans. Cell Metabolism, 2017, 26(2): 292-300.

[2] 張龍, 朱方俊, 王彥, 蘭茜, 呂榮平, 劉益平, 朱慶. 雞FATP1基因多態性與屠體性狀的相關分析. 中國農業科學, 2009, 42(9): 3272-3278.

ZHANG L, ZHU F J, WANG Y, LAN X, Lü R P, LIU Y P, ZHU Q. Correlation analysis betweengene polymorphism and carcass traits in chicken. Scientia Agricultura Sinica, 2009, 42(9): 3272-3278. (in Chinese)

[3] 華緒川, 張立凡, 蔡兆偉, 蔣曉玲, 徐寧迎, 張金枝. 豬FATP1基因5’調控區多態性及其與脂肪性狀的相關分析. 江蘇農業學報, 2011, 27(1): 89-93.

HUA X C, ZHANG L F, CAI Z W, JIANG X L, XU N Y, ZHANG J Z. Polymorphism in 5’regulatory region ofgene and its association with fat traits. Jiangsu Journal of Agricultural Sciences, 2011, 27(1): 89-93. (in Chinese)

[4] 黃業傳, 賀稚非, 李洪軍, 秦剛, 王庭, 馬明輝. 皮下脂肪和肌內脂肪對豬肉風味的作用. 中國農業科學, 2011, 44(10): 2118-2130. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2011.10.017.

HUANG Y C, HE Z F, LI H J, QIN G, WANG T, MA M H. The flavor contribution of subcutaneous and intramuscular fat to pork. Scientia Agricultura Sinica, 2011, 44(10): 2118-2130. doi:10.3864/j.issn. 0578-1752.2011.10.017. (in Chinese)

[5] STAHL A, EVANS J G, PATTEL S, HIRSCH D, LODISH H F. Insulin causes fatty acid transport protein translocation and enhanced fatty acid uptake in adipocytes. Developmental Cell, 2002, 2(4): 477-488.

[6] GIMENO R E. Fatty acid transport proteins. Current Opinion in Lipidology, 2007, 18(3): 271-276.

[7] KAZANTZIS M, STAHL A. Fatty acid transport proteins, implications in physiology and disease. Biochimica et Biophysica Acta, 2012, 1821(5): 852-857.

[8] POHL J, RING A, HERMANN T, STREMMEL W. Role of FATP in parenchymal cell fatty acid uptake. Biochimica et Biophysica Acta, 2004, 1686(1/2): 1-6.

[9] WU Q W, ORTEGON A M, TSANG B, DOEGE H, FEINGOLD K R, STAHL A. FATP1 is an insulin-sensitive fatty acid transporter involved in diet-induced obesity. Molecular and Cellular Biology, 2006, 26(9): 3455-3467.

[10] SCHAFFER J E, LODISH H F. Expression cloning and characterization of a novel adipocyte long chain fatty acid transport protein. Cell, 1994, 79(3): 427-436.

[11] GUITART M, OSORIO-CONLES O, PENTINAT T, CEBRIà J, GARCíA-VILLORIA J, SALA D, SEBASTIáN D, ZORZANO A, RIBES A, JIMéNEZ-CHILLARóN J C, GARCíA-MARTíNEZ C, GóMEZ-FOIX A M. Fatty acid transport protein 1 (FATP1) localizes in mitochondria in mouse skeletal muscle and regulates lipid and ketone body disposal. PLoS ONE, 2014, 9(5): e98109.

[12] ORDOVáS L, ROY R, ZARAGOZA P, RODELLAR C. Structural and functional characterization of the bovine solute carrier family 27 member 1 () gene. Cytogenetic and Genome Research, 2006, 115(2): 115-122.

[13] LEWIS S E, LISTENBERGER L L, ORY D S, SCHAFFER J E. Membrane topology of the murine fatty acid transport protein 1. Journal of Biological Chemistry, 2001, 276(40): 37042-37050.

[14] CHEN X L, LUO Y L, WANG R S, ZHOU B, HUANG Z Q, JIA G, ZHAO H, LIU G M. Effects of fatty acid transport protein 1 on proliferation and differentiation of porcine intramuscular preadipocytes. Animal Science Journal, 2017, 88(5): 731-738.

[15] WANG H, WANG J, YANG D D, LIU Z L, ZENG Y Q, CHEN W. Expression of lipid metabolism genes provides new insights into intramuscular fat deposition in Laiwu pigs. Asian-Australasian Journal of Animal Sciences, 2020, 33(3): 390-397.

[16] COE N R, SMITH A J, FROHNERT B I, WATKINS P A, BERNLOHR D A. The fatty acid transport protein (FATP1) is a very long chain acyl-CoA synthetase. Journal of Biological Chemistry, 1999, 274(51): 36300-36304.

[17] HALL A M, SMITH A J, BERNLOHR D A. Characterization of the acyl-CoA synthetase activity of purified murine fatty acid transport protein 1. Journal of Biological Chemistry, 2003, 278(44): 43008- 43013.

[18] HALL A M, WICZER B M, HERRMANN T, STREMMEL W, BERNLOHR D A. Enzymatic properties of purified murine fatty acid transport protein 4 and analysis of acyl-CoA synthetase activities in tissues from FATP4 null mice. Journal of Biological Chemistry, 2005, 280(12): 11948-11954.

[19] HEATHER L C, COLE M A, LYGATE C A, EVANS R D, STUCKEY D J, MURRAY A J, NEUBAUER S, CLARKE K. Fatty acid transporter levels and palmitate oxidation rate correlate with ejection fraction in the infarcted rat heart. Cardiovascular Research, 2006, 72(3): 430-437.

[20] ZHANG M M, DI MARTINO J S, BOWMAN R L, CAMPBELL N R, BAKSH S C, SIMON-VERMOT T, KIM I S, HALDEMAN P, MONDAL C, YONG-GONZALES V, ABU-AKEEL M, MERGHOUB T, JONES D R, ZHU X G, ARORA A, ARIYAN C E, BIRSOY K, WOLCHOK J D, PANAGEAS K S, HOLLMANN T, BRAVO-CORDERO J J, WHITE R M. Adipocyte-derived lipids mediate melanoma progression via FATP proteins. Cancer Discovery, 2018, 8(8): 1006-1025.

[21] ZHAN T Z, POPPELREUTHER M, EHEHALT R, FüLLEKRUG J. Overexpressed FATP1, ACSVL4/FATP4 and ACSL1 increase the cellular fatty acid uptake of 3T3-L1 adipocytes but are localized on intracellular membranes. PLoS ONE, 2012, 7(9): e45087.

[22] STAHL A. A current review of fatty acid transport proteins (SLC27). Pflügers Archiv, 2004, 447(5): 722-727.

[23] DOEGE H, STAHL A. Protein-mediated fatty acid uptake: novel insights frommodels. Physiology (Bethesda, Md), 2006, 21: 259-268.

[24] STEFANYK L E, BONEN A, DYCK D J. Insulin and contraction- induced movement of fatty acid transport proteins to skeletal muscle transverse-tubules is distinctly different than to the sarcolemma. Metabolism, 2012, 61(11): 1518-1522.

[25] WICZER B M, LOBO S, MACHEN G L, GRAVES L M, BERNLOHR D A. FATP1 mediates fatty acid-induced activation of AMPK in 3T3-L1 adipocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2009, 387(2): 234-238.

[26] GARCíA-MARTíNEZ C, MAROTTA M, MOORE-CARRASCO R, GUITART M, CAMPS M, BUSQUETS S, MONTELL E, GóMEZ- FOIX A M. Impact on fatty acid metabolism and differential localization of FATP1 and FAT/CD36 proteins delivered in cultured human muscle cells. American Journal of Physiology Cell Physiology, 2005, 288(6): C1264-C1272.

[27] KIM J K, GIMENO R E, HIGASHIMORI T, KIM H J, CHOI H, PUNREDDY S, MOZELL R L, TAN G, STRICKER-KRONGRAD A, HIRSCH D J, FILLMORE J J, LIU Z X, DONG J Y, CLINE G, STAHL A, LODISH H F, SHULMAN G I. Inactivation of fatty acid transport protein 1 prevents fat-induced insulin resistance in skeletal muscle. The Journal of Clinical Investigation, 2004, 113(5): 756-763.

[28] 池永東, 王永, 胡萌, 何小芳, 朱江江, 趙越, 林亞秋. 山羊不同組織器官的內參基因篩選. 基因組學與應用生物學, 2020, 39(2): 561-567.

CHI Y D, WANG Y, HU M, HE X F, ZHU J J, ZHAO Y, LIN Y Q. Screening of internal reference genes in different tissues and organs of goats. Genomics and Applied Biology, 2020, 39(2): 561-567. (in Chinese)

[29] 許晴, 林森, 朱江江, 王永, 林亞秋. 山羊肌內前體脂肪細胞誘導分化過程中內參基因的表達穩定性分析. 畜牧獸醫學報, 2018, 49(5): 907-918.

XU Q, LIN S, ZHU J J, WANG Y, LIN Y Q. The expression stability analysis of reference genes in the process of goat intramuscular preadipocytes differentiation in goat. Chinese Journal of Animal and Veterinary Sciences, 2018, 49(5): 907-918. (in Chinese)

[30] 蔡勇, 阿依木古麗, 臧榮鑫, 劉翊中, 楊具田, 喬自林, 曹忻, 徐紅偉, 吳建平. 不同凍存保護劑對綿羊前體脂肪細胞凍存效果的影響. 中國農業科學, 2012, 45(7): 1439-1446.

CAI Y, AYIMUGULI, ZANG R X, LIU Y Z, YANG J T, QIAO Z L, CAO X, XU H W, WU J P. Effects of different cryoprotectants on ovine preadipocytes cryopreservation. Scientia Agricultura Sinica, 2012, 45(7): 1439-1446. (in Chinese)

[31] HATCH G M, SMITH A J, XU F Y, HALL A M, BERNLOHR D A. FATP1 channels exogenous FA into 1, 2, 3-triacyl--glycerol and down-regulates sphingomyelin and cholesterol metabolism in growing 293 cells. Journal of Lipid Research, 2002, 43(9): 1380-1389.

[32] WU Q W, KAZANTZIS M, DOEGE H, ORTEGON A M, TSANG B, FALCON A, STAHL A. Fatty acid transport protein 1 is required for nonshivering thermogenesis in brown adipose tissue. Diabetes, 2006, 55(12): 3229-3237.

[33] QI R L, LONG D B, WANG J, WANG Q, HUANG X F, CAO C T, GAO G L, HUANG J X. MicroRNA-199a targets the fatty acid transport protein 1 gene and inhibits the adipogenic trans- differentiation of C2C12 myoblasts. Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology, 2016, 39(3): 1087-1097.

[34] DIRUSSO C C, LI H, DARWIS D, WATKINS P A, BERGER J, BLACK P N. Comparative biochemical studies of the murine fatty acid transport proteins (FATP) expressed in yeast. Journal of Biological Chemistry, 2005, 280(17): 16829-16837.

[35] LOBO S, WICZER B M, SMITH A J, HALL A M, BERNLOHR D A. Fatty acid metabolism in adipocytes: functional analysis of fatty acid transport proteins 1 and 4. Journal of Lipid Research, 2007, 48(3): 609-620.

[36] QIU F F, XIE L, MA J G, LUO W, ZHANG L, CHAO Z, CHEN S H, NIE Q H, LIN Z M, ZHANG X Q. Lower expression ofenhances intramuscular fat deposition in chicken via down-regulated fatty acid oxidation mediated by. Frontiers in Physiology, 2017, 8: 449.

[37] NICKERSON J G, ALKHATEEB H, BENTON C R, LALLY J, NICKERSON J, HAN X X, WILSON M H, JAIN S S, SNOOK L A, GLATZ J F C, CHABOWSKI A, LUIKEN J J F P, BONEN A. Greater transport efficiencies of the membrane fatty acid transporters FAT/CD36 and FATP4 compared with FABPpm and FATP1 and differential effects on fatty acid esterification and oxidation in rat skeletal muscle. Journal of Biological Chemistry, 2009, 284(24): 16522-16530.

[38] SEBASTIáN D, GUITART M, GARCíA-MARTíNEZ C, MAUVEZIN C, ORELLANA-GAVALDà J M, SERRA D, GóMEZ-FOIX A M, HEGARDT F G, ASINS G. Novel role of FATP1 in mitochondrial fatty acid oxidation in skeletal muscle cells. Journal of Lipid Research, 2009, 50(9): 1789-1799.

[39] CHIU H C, KOVACS A, BLANTON R M, HAN X L, COURTOIS M, WEINHEIMER C J, YAMADA K A, BRUNET S, XU H D, NERBONNE J M, WELCH M J, FETTIG N M, SHARP T L, SAMBANDAM N, OLSON K M, ORY D S, SCHAFFER J E. Transgenic expression of fatty acid transport protein 1 in the heart causes lipotoxic cardiomyopathy. Circulation Research, 2005, 96(2): 225-233.

[40] HUANG J P, ZHU R R, SHI D S. The role of FATP1 in lipid accumulation: a review. Molecular and Cellular Biochemistry, 2021, 476(4): 1897-1903.

[41] HOLLOWAY G P, CHOU C J, LALLY J, STELLINGWERFF T, MAHER A C, GAVRILOVA O, HALUZIK M, ALKHATEEB H, REITMAN M L, BONEN A. Increasing skeletal muscle fatty acid transport protein 1 (FATP1) targets fatty acids to oxidation and does not predispose mice to diet-induced insulin resistance. Diabetologia, 2011, 54(6): 1457-1467.

[42] FROHNERT B I, HUI T Y, BERNLOHR D A. Identification of a functional peroxisome proliferator-responsive element in the murine fatty acid transport protein gene. Journal of Biological Chemistry, 1999, 274(7): 3970-3977.

[43] YE G Z, GAO H, WANG Z C, LIN Y, LIAO X, ZHANG H, CHI Y L, ZHU H M, DONG S J. PPARα and PPARγ activation attenuates total free fatty acid and triglyceride accumulation in macrophages via the inhibition of Fatp1 expression. Cell Death & Disease, 2019, 10: 39.

[44] CHOI H, KIM S J, PARK S S, CHANG C, KIM E. TR4 activatesgene expression to promote lipid accumulation in 3T3-L1 adipocytes. FEBS Letters, 2011, 585(17): 2763-2767.

[45] PROSDOCIMO D A, ANAND P, LIAO X D, ZHU H, SHELKAY S, ARTERO-CALDERON P, ZHANG L L, KIRSH J, MOORE D, ROSCA M G, VAZQUEZ E, KERNER J, AKAT K M, WILLIAMS Z, ZHAO J H, FUJIOKA H, TUSCHL T, BAI X D, SCHULZE P C, HOPPEL C L, JAIN M K, HALDAR S M. Kruppel-like factor 15 is a critical regulator of cardiac lipid metabolism. Journal of Biological Chemistry, 2014, 289(9): 5914-5924.

[46] ZHAO Z D, TIAN H S, SHI B G, JIANG Y Y, LIU X, HU J. Transcriptional regulation of the bovine fatty acid transport protein 1 gene by Krüppel-like factors 15. Animals: an Open Access Journal from MDPI, 2019, 9(9): 654.

[47] 朱江江, 林亞秋, 王永, 林森. 山羊Kruppel樣轉錄因子家族在前體脂肪細胞分化中的表達模式及相關性分析. 中國農業科學, 2019, 52(13): 2341-2351. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.13.012.

ZHU J J, LIN Y Q, WANG Y, LIN S. Expression profile and correlations of kruppel like factors during caprine() preadipocyte differentiation. Scientia Agricultura Sinica, 2019, 52(13): 2341-2351. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.13.012. (in Chinese)

[48] MAK H Y. Lipid droplets as fat storage organelles in: thematic Review Series: Lipid Droplet Synthesis and Metabolism: from Yeast to Man. Journal of Lipid Research, 2012, 53(1): 28-33.

[49] XU N Y, ZHANG S O, COLE R A, MCKINNEY S A, GUO F L, HAAS J T, BOBBA S, FARESE R V Jr, MAK H Y. The FATP1-DGAT2 complex facilitates lipid droplet expansion at the ER-lipid droplet interface. The Journal of Cell Biology, 2012, 198(5): 895-911.

Role of

LI Qi1, YANG ChangHeng1, WANG Yong1, LIN YaQiu1, 2, XIANG Hua2, ZHU Jiangjiang1, 2

1Qinghai-Tibetan Plateau Animal Genetic ResourceReservation and Utilization Key Laboratory of Sichuan Province/Southwest Minzu University, Chengdu 610041;2Key Laboratory of Qinghai-Tibetan Plateau Animal Genetic Resource Reservation and Utilization of Ministry of Education/Southwest Minzu University, Chengdu 610041

【Background】Fatty acid transporter 1 (FATP1) can promote the uptake of fatty acids in mammals. This process is very important to maintain the balance of lipid metabolism, and also has an important impact on the meat quality of livestock.【Objective】The aim of this study was to obtain the CDS sequence of goatgene, to detect the expression ofgene in different tissues of goats, and to explore its effect on lipid metabolism of goat intramuscular adipocytes, so as to provide a reference for further revealing the mechanism ofgene in goat lipid metabolism, which can provide a theoretical basis for genetic and breeding improvement of goats.【Method】The CDS of goatgene was cloned by real-time fluorescence quantitative PCR (RT-PCR), its biological characteristics, such as hydrophobicity, transmembrane region and signal peptide, were analyzed by online tools, and its amino acid sequence phylogenetic tree was constructed. The expression level ofgene in different goat tissues was detected by RT-qPCR and its tissue expression pattern was constructed. The constructed eukaryotic expression vector and screened siRNA were used to overexpress and interfere with FATP1 in goat intramuscular adipocytes, the effects ofgene overexpression and interference on lipid deposition in goat intramuscular adipocytes were detected by oil red O staining and triglyceride determination, and the effects ofgene overexpression and interference on the expression of genes related to lipid metabolism were further explored by RT-qPCR. 【Result】The CDS ofgene was 1 941 bp, encoding 646 amino acids residues. It was predicted that its molecular formula was C3196H5026N884O898S25, and the protein was a basic hydrophobic stable protein. Phylogenetic tree analysis of amino acid sequence showed that goat FATP1 was closely related to sheep. RT-qPCR showed that the expression ofgene was the highest in goat small intestine. Oil red O staining and triglyceride determination showed that the number of lipid droplets and triglyceride content in goat intramuscular adipocytes increased after overexpression of FATP1, but the opposite results were obtained after interference with FATP1. After overexpression of FATP1 in goat adipocytes, the expression levels of fatty acid synthesis, transport and other related genes(＜0.01),(＜0.01),(＜0.01),(＜0.01),(＜0.01),(＜0.01) and(＜0.05) increased significantly, while the expression level of lipolysis related genes(＜0.01) decreased significantly. After interfering FATP1, the expression of fatty acid transport, elongation and other related genes(＜0.01),(＜0.01) and(＜0.05) decreased significantly, and the expression of lipolysis related genes(＜0.01) and(＜0.05) increased significantly. 【Conclusion】FATP1 might significantly promote the lipid deposition of goat intramuscular precursor adipocytes by promoting the expression of genes related to cell lipid production and reducing the expression of genes related to lipolysis, which provided an experimental reference for further revealing the role and molecular mechanism of FATP1 gene in regulating lipid metabolism.

goat; FATP1; intramuscular adipocytes; lipid deposition

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.10.015

2021-12-02；

2022-10-31

國家自然科學基金（32072723）、國家重點研發計劃（2016YFC0500709）、四川省科技計劃項目（2020JDJQ0010，2021YFYZ0003）、中央高校基本科研業務費專項基金（2021PTJS21）

李琪，E-mail：liqiligexiao@outlook.com。通信作者 朱江江，E-mail：zhujiang4656@hotmail.com。通信作者向華，E-mail：xianghua2008411@163.com

（責任編輯 林鑒非）