猴樟CbP5CR基因克隆及生物信息學分析

黃東莉 何敏 紀洪玲 陸林燕 嚴功力 張穎 張麗華

摘要 為研究猴樟CbP5CR蛋白的序列結構和功能，克隆猴樟CbP5CR基因CDS序列，進行生物信息學分析。結果表明，克隆得到的序列具有一個810 bp完整的ORF框，編碼269個氨基酸，與沉水樟中收錄的RWR74447.1基因序列一致性達98.88%，系統進化樹的結果表明，猴樟CbP5CR蛋白具有較高的保守性；猴樟CbP5CR蛋白生物信息學分析結果表明，CbP5CR蛋白具有PLN02688家族結構域，CbP5CR蛋白化學分子式為C1242H2015N345O375S7，相對分子量28.01 kD，理論等電點7.03，結構穩定，不存在氨基酸無序化區域，為脂溶性和親水性蛋白，磷酸化氨基酸位點有45個，亞細胞定位預測為細胞質。

關鍵詞 猴樟；轉錄因子；基因克隆；生物信息學分析

中圖分類號 S792? ?文獻標識碼 A

文章編號 1007-7731（2023）04-0022-04

猴樟（Cinnamomun bodinieri Levl.）是我國重要的綠化樹種、經濟樹種和林用樹種，主要分布于我國南方地區。近幾年，猴樟產業因其生長速度快、抗性強而迅速發展起來[1]，并逐漸向我國長江以北地區推廣應用，而北方地區堿性土壤環境限制了猴樟的生產栽培。植物耐堿性能與其根系適應堿脅迫的策略密切相關，包括膜穩定性、抗氧化系統、滲透調節和離子平衡等方面，脯氨酸的生物合成和積累是植物應對逆境脅迫的主要方式，逆境脅迫下可以作為滲透調節物防止細胞脫水，還是生物大分子的保護劑和羥基清除劑，同時還可為植物從脅迫條件恢復而提供氮源、碳源和還原劑，耐堿性強的品種含有更高的脯氨酸含量[2]。以往研究認為，在多種脅迫條件下P5CR、P5CS、δ-OAT基因的表達量增加，而PDH基因的表達量降低，脯氨酸積累[3]，但植物體內脯氨酸的積累與植物的抗逆性之間的關系在不同植物之間存在差異，其在賦予耐受性方面的實際作用仍然存在爭議。該研究基于轉錄組數據克隆出猴樟脯氨酸合成關系酶基因序列，并分析其特性，以期為猴樟耐堿性機理研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為耐堿猴樟變種2年生種苗，于2019年2月上旬播種，2021年4月上旬進行移栽。于2022年3月10日取猴樟枝條頂部幼嫩芽片液氮速凍后，用RNAperp Pure Plant Kit（天根，北京）試劑盒提取材料的總RNA，按照PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa，大連）方法去除基因組DNA后，用TR Prime Mix（random primer）進行反轉錄反應，獲得的cDNA產物作為模板。

1.2 基因克隆

根據猴樟轉錄組數據，獲得在耐堿性猴樟變種葉片中調控脯氨酸合成的關鍵酶基因序列，使用Primer Premier 5.0軟件設計CDS擴增引物［F（5'—3'）：ATGGCAACAGCAGAGACG；R（5'—3'）：CTAGAGAGTGTGCTACTC］，PCR反應采用25 μL體系[4]，反應產物直接轉化大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α感受態細胞（TSINGKE，北京），挑單菌落進行PCR鑒定，將PCR陽性菌落培養后，提取質粒送擎科生物技術有限公司測序。

1.3 生物信息學分析

通過ORF Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）將猴樟CbP5CR基因翻譯成蛋白序列；利用NCBI的CCD工具（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）進行蛋白結構域預測；利用Protparam（http：//web.expasy.org/protparam/）對氨基酸序列的理化性質和等電點進行分析；采用Prot Scale（https：//web.expasy.org/protscale/）進行蛋白質的親/疏水性預測；采用PRABI（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl）在線軟件進行蛋白二級結構分析；利用Fold Index 軟件（https：//fold.weizmann.ac.il/fldbin/findex）分析氨基酸折疊無序化特性分析；采用SoftBerry ProtComp 9. 0（http：//linux1.softberry.com/）和Cell-PLoc 2.0在線分析軟件（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）進行蛋白亞細胞定位；采用Swiss-Model（http：//www.Swissmodel.expasy.org）預測蛋白質三級結構，并利用PyMOL軟件生成三級結構模型；利用MEGA 7.0作出與CbP5CR的CDS序列同源性較近的物種序列進化樹。

2 結果與分析

2.1 猴樟CbP5CR基因的克隆與重組載體構建

根據克隆后的凝膠電泳圖片（圖1），以猴樟的cDNA為模板，通過PCR擴增得到1條約900 bp的條帶，片段大小與預期一致，通過測序得到長864 bp的CDS序列。PCR產物送公司測序，測序結果與沉水樟中收錄的RWR74447.1基因進行比對，序列一致性高達98.88%，具備P5CR的功能。將克隆獲得的基因編碼蛋白通過NCBI BLAST Protein與數據庫進行比對，根據比對結果顯示，所克隆得到的序列具有一個810 bp完整的ORF框，推導編碼269個氨基酸，將獲得的目的基因命名為CbP5CR。

2.2 猴樟CbP5CR蛋白的生物信息學分析

2.2.1 猴樟CbP5CR蛋白的理化性質分析。利用Protparam軟件對猴樟CbP5CR蛋白的理化性質進行分析，猴樟CbP5CR蛋白相對分子量28.01 kDa，理論等電點7.03，表明CbP5CR基因編碼蛋白為中性，化學分子式為C1242H2015N345O375S7，原子總數為3 984，不穩定指數值為37.12，不穩定系數大于40時為不穩定蛋白，因而該蛋白質穩定。脂溶指數為99.85，CbP5CR基因編碼蛋白為脂溶性蛋白，帶負電荷的殘基（asp+glu）總數為26，帶正電荷的殘基（arg+lys）總數為26。利用NCBI的CCD工具（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）進行蛋白結構域預測，結果表明（圖2），CbP5CR蛋白具有PLN02688家族結構域，具備脯氨酸合成酶功能。利用Prot Scale（https：//web.expasy.org/protscale/）對猴樟CbP5CR基因編碼蛋白的親水性進行分析（圖3），總平均親水性值（GRAVY）為0.184，預測該蛋白為親水性蛋白。通常認為，氨基酸分值越低親水性越強，分值越高疏水性越強，猴樟CbP5CR基因編碼蛋白各氨基酸序列中第43、44位氨基酸分值最低為-2.878，親水性值最強；第99位氨基酸分值最高，為2.544，疏水性最強，就整體分析而言，蛋白序列中36～49、105～115、139～150、218～233位氨基酸均為連續排列的親水性氨基酸，推測猴樟CbP5CR基因編碼蛋白為親水性蛋白。

2.2.2 猴樟CbP5CR蛋白二、三級結構預測。蛋白亞細胞定位結果表明該蛋白定位于細胞質。根據蛋白二級結構在線預測結果（圖4），該蛋白組成中135個氨基酸（50.19%）為α-螺旋、30個氨基酸（11.15%）為延伸主鏈，104個氨基酸（38.66%）為隨機卷曲，因而猴樟CbP5CR主要由α-螺旋和隨機卷曲組成；利用Fold Index對猴樟CbP5CR蛋白進行氨基酸序列折疊無序化分析（圖5），結果表明，該蛋白不存在氨基酸無序化區域，折疊無序化指數為0.299。利用Net Phos 3.1（https：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）進行蛋白磷酸化位點預測（圖6），該多肽鏈0.500以上分值的氨基酸位點為45個，其中包含32個絲氨酸（S）、11個蘇氨酸（T）和2個酪氨酸（Y）磷酸化位點。根據蛋白三級結構預測結果和同源建模分析（圖7），CbP5CR編碼蛋白三級結構與5bse.1.A的氨基酸序列一致性達68.28%，5bse.1.A序列的編碼蛋白為Pyrroline-5-carboxylate reductase（P5CR）。

2.2.3 猴樟CbP5CR蛋白序列同源比對及系統進化樹。在NCBI數據庫中對猴樟CbP5CR蛋白序列進行blastp比對，根據結果下載比對得分較高的氨基酸序列，再通過MEGA 7.0軟件構建CbP5CR蛋白系統進化樹（圖8）。結果表明，猴樟CbP5CR蛋白在進化上與同為樟科樟屬的沉水樟聚為一類，說明其親緣關系最近，樟科樟屬植物中該類蛋白具有較高的保守性。猴樟CbP5CR蛋白進化樹中大概分3類，其中猴樟與沉水樟歸為一類，其次是絨毛狀煙草、煙草、番茄、蒂羅花、黃連、博羅回和罌粟歸為一類，與猴樟親緣關系更遠的石刁柏、黃石斛、深圳擬蓮、薯蕷、小果野芭蕉、油棕和姜歸為一類。

3 結論與討論

脯氨酸是植物體內水合能力最強的氨基酸，具有分子量小、對細胞無毒副作用等特征，外源施用脯氨酸能夠促進植物光合能力和水分利用能力[5]，還能通過誘導植物抗氧化酶活性提高抗鹽堿脅迫能力。在高等植物體內，脯氨酸通過谷氨酸途徑和鳥氨酸途徑在細胞質、葉綠體和線粒體中合成，在線粒體內進行降解，吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）、鳥氨酸-δ-氨基轉移酶（δ-OAT）和脯氨酸脫氫酶（ProDH）基因被認為是關鍵基因[2]。該研究結果表明，克隆得到的序列具有一個810 bp完整的ORF框，編碼269個氨基酸，與沉水樟中收錄的RWR74447.1基因序列一致性達98.88%，系統進化樹的結果表明，猴樟CbP5CR蛋白具有較高的保守性；猴樟CbP5CR蛋白生物信息學分析結果表明，CbP5CR蛋白具有PLN02688家族結構域，CbP5CR蛋白化學分子式為C1242H2015N345O375S7，相對分子量28.01 kDa，理論等電點7.03，結構穩定，不存在氨基酸無序化區域，為脂溶性和親水性蛋白，磷酸化氨基酸位點有45個，亞細胞定位預測為細胞質，研究結果為進一步研究猴樟脯氨酸代謝調控耐堿性機理提供了基礎。

4 參考文獻

[1] 韓浩章，張麗華，王曉立，等.猴樟與香樟幼苗的耐鹽堿性比較［J］.西部林業科學，2019，48（5）：7-14.

[2] 邢曉琳.外源脯氨酸和水楊酸對鹽堿脅迫下紫花苜蓿生理特性及抗氧化酶基因表達的影響[D].沈陽：遼寧大學，2020.

[3] KIARASH J G，AMIN B，MALIHE A，et al.Effects of salinity stress on proline content and expression of Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthase and vacuolar-type H+ subunit E genes in wheat[J].Plant Genetic Resources，2020，18（5）：334-342.

[4] 韓浩章，張麗華，李素華，等.猴樟CbP5CS1基因克隆及表達載體構建[J/OL].分子植物育種：1-9.http：//kns.cnki.net/kcms/detail/46.1068.S.20210720.1751.012.html.

[5] NOREEN S， AKHTERM S， YAAMIN T， et al. The ameliorative effects of exogenously applied proline on physiological and biochemical parameters of wheat （Triticum aestivum L.） crop under copper stress condition[J]. J. Plant Interact，2018，13：221-230.

（責編：王慧晴）