新疆地區原發性肝癌腫瘤同時性轉移基因差異表達*

張麗萍，馬曉麗，盧曉梅，孫剛，張莉，姚文兵

1新疆醫科大學 藥學院，烏魯木齊 830011；新疆醫科大學第一附屬醫院 2綜合內四科;3臨床研究院，烏魯木齊 830054；4新疆醫科大學附屬腫瘤醫院 乳腺甲狀腺外科，烏魯木齊 830000；5新疆醫科大學第一附屬醫院 綜合內一科，烏魯木齊 830000；6中國藥科大學 生命科學與技術學院，南京210009

原發性肝癌是世界范圍內最常見的腫瘤之一，尤其在發展中國家，其發病率持續上升[1]。我國肝癌發病人數和死亡人數約占全球一半，特別是作為多民族聚居地的新疆地區，其高發病情況呈現獨特地域特色[2]。導致肝癌具有較高病死率的原因是病灶的復發和轉移，但肝癌轉移的機制尚不清楚[3，4]。

腫瘤異質性表現為病理類型的不同，對手術、放療和化療等治療敏感性不同，以及患者預后的差異[5]。在研究原發性肝癌伴肝外惡性腫瘤中發現其具有原發性肝癌的基本特征，可為早期診治提供可能[6]。因此，研究腫瘤異質性對指導肝癌診斷和治療具有重大意義。本研究基于下一代測序技術（nextgeneration sequencing，NGS），通過檢測配對的原發灶和轉移灶基因突變的異同，分析原發灶與轉移灶之間基因突變的差異、所涉及的信號通路和藥物作用靶點，以期為肝癌的精準治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床病例

收集新疆醫科大學第一附屬醫院2018 年1 月～2021 年5 月經病理證實為首次出現同時性轉移的原發性肝癌且術前未經放化療及生物免疫治療的組織蠟塊。肝癌同時性轉移是指轉移灶和原發灶同時發生或根除術后6 個月內發生轉移。共收集原發灶及配對轉移灶標本21 例（漢族15 例、維吾爾族3例和哈薩克族3 例），其中肝內轉移3 例，肝門淋巴結轉移3 例，脾動脈周圍淋巴結轉移3 例，肛門部淋巴結轉移6 例，膈肌轉移3 例，腎上腺轉移3 例。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA 的提取 將切片去除多余的石蠟，按照Qiagen 公司的QIAamp DNA FFPE 組織提取試劑盒提取，得基因組DNA。

1.2.2 NGS 突變檢測 將已提取的DNA 標本取出，使用Ion Torrent PGM 二代測序平臺檢測原發灶和轉移灶相關基因的突變基因。

1.2.3 生物信息學分析 以ProtonTMTorrent 服務器預加載Torrent Suite 軟件，對外顯子測序數據進行數據分析，作覆蓋分析、變異識別等檢測，用FPKM法計算樣本的表達量，Fold-change 法分析基因的差異表達，發現新基因后，用Ion ReporterTM軟件進行生物學功能注釋和常見變異體的鑒定，并對差異表達進行聚類分析、KEGG Pathway 功能富集分析。

1.2.4 統計學分析 應用SPSS 26.0 軟件分析數據，并用Kaplan-Meier 單因素生存分析統計患者基因突變及臨床資料與總生存期（overall survival，OS）間的相關性，P ＜0.05 為差異有統計學意義。

1.2.5 隨訪 采用電話或門診的隨訪方式，對篩選的21 例患者隨訪至2022 年2 月，主要終點事件為患者死亡，次要終點事件為隨訪時間截止、隨訪期間內發生其他臟器功能衰竭難以配合后續隨訪工作。

2 結果

2.1 原發灶和轉移灶的基因特征

原發性肝癌標本中原發灶和轉移灶共同顯示出突變率最高的10 種基因：MUC16（43%）、TTN（36%）、ZAN（29%）、MYO18B（29%）、DNAH7（29%）、DNAH10（29%）、DMLX2（29%）、DCC（29%）、CSMD1（29%）、CDLSR2（29%）。原發灶和轉移灶之間異質性不明顯（P＞0.05）。轉移灶中基因突變率高于原發灶。見圖1。

圖1 原發性肝癌標本中原發灶和轉移灶共同突變的10 種基因

2.2 原發灶和轉移灶基因突變類型

基因變異分類主要為錯義突變，其次為無義突變，移碼缺失、框內缺失、剪切位點突變、框內插入、移碼插入的突變類型出現較少。進一步細分，又以基因組水平上單個核苷酸的變異所引起的DNA 序列多態性即（single nucleotide polymorphism，SNP）最多見，插入和缺失的突變類型占比極少。在堿基突變中，C ＞A 替換發生頻率最高，C ＞T 替換的發生頻率次之，C ＞G 替換、T ＞C 替換、T ＞G 替換、T ＞A替換的發生頻率較低。這說明嘌呤與嘧啶之間的顛換高于嘌呤與嘌呤之間的轉換。見圖2。

圖2 原發性肝癌原發灶和轉移灶基因突變類型

2.3 基因突變與臨床特征的關系

TTN 基因突變與性別、族別、分化程度相關（P ＜0.005），與年齡不相關（P ＞0.05），見表1；MYO18B基因突變與族別相關（P=0.043），與性別、年齡、分化程度不相關（P ＞0.05）；其余基因與性別、年齡、分化程度、族別均不相關（P ＞0.05），見表2。

表1 原發灶和轉移灶中TTN 突變與臨床特征的關系

表2 原發灶和轉移灶中MYO18B 突變與臨床特征的關系

2.4 原發灶與轉移灶突變基因的共存和互排情況

在突變率最高的前10 個基因里，原發灶中TTN 與ZNF208、ZDBF2、VCPIP1、USP34 存在強烈的突變共存現象并表現出相關性；轉移灶中HHIPL2 與MYO18B、ADCYAP1 與MUC16 分別存在強烈的突變共存現象并表現出相關性。見圖3。

圖3 原發性肝癌原發灶（A）和轉移灶（B）基因共存

2.5 基因突變與生存的關系

隨訪至2022 年2 月，21 例患者中3 例存活至今，18 例生存期為6～10 個月，中位生存期為7 個月。TTN 突變（P=0.023）與原發性肝癌患者的OS相關，表明TTN 突變可能是影響原發性肝癌術后患者預后的獨立因素，TTN 突變使患者的生存期縮短。性別、年齡、民族、T 分期、淋巴結轉移數目、遠端轉移數目、MUC16 突變、MYO18B 突變、CSMD1 突變與OS 均無顯著相關性。見圖4。

圖4 MUC16、TTN、MYO18B、CSMD1 突變生存函數單因素分析

2.6 基因突變涉及的原發灶和轉移灶共同的信號通路及基因變異數

本研究檢測出8 種信號通路，見圖5。

圖5 原發性肝癌信號通路基因變異數

2.7 原發灶與轉移灶中突變基因的藥物作用靶點

原發灶和轉移灶中突變基因的共同藥物作用靶點有10 個，分別是可成藥基因組（druggable genome）、絲氨酸/蘇氨酸激酶（serine threonine kinase）、離子通道（ion channel）、腫瘤抑制因子（tumor suppressor）、酪氨酸激酶（tyrosine kinase）、DNA 修復因子（DNA repair）、復雜轉錄因子（transcription factor complex）、轉錄因子結合位點（transcription factor binding）、腫瘤治療靶點基因組（clinically actionable）、ABC 轉運體（ABC transporter）。見圖6。

圖6 原發性肝癌原發灶（A）和轉移灶（B）中突變基因的藥物作用靶點

3 討論

本研究結果顯示原發灶和轉移灶異質性不明顯，其原因可能為本納入的對象均為初次診斷原發性肝癌同時性轉移，未經放化療、免疫治療，屬于肝癌早期轉移，且大部分為區域淋巴結轉移及局部侵犯，遠處轉移較少。有研究發現[7，8]，多發肝癌中原發腫瘤、門靜脈癌栓及肝內轉移具有相似的基因表達圖譜，這與本研究一致，因此，實驗后期會跟進隨訪，對存活患者加入肝癌遠端轉移的研究，原發灶與遠端轉移灶的NGS 測序結果，進一步探尋腫瘤的異質性。由于原發灶和轉移灶同時發生或者兩者發生時間間隔較短，所以肝癌干細胞的自我更新和分化程度可能相對較低，這也是肝癌腫瘤異質性不明顯的原因之一。

MUC16 在肝癌的發生發展中發揮重要作用，本研究中MUC16 的突變率最高，達43%。有研究表明MUC16 在肝癌組織中的表達高于正常組織，且該基因與肝癌患者的總生存相關[9]。本研究發現原發性肝癌少見且與預后相關的突變基因TTN。Zou S等[10]也研究發現，TTN 基因在肺鱗狀細胞癌中異常表達，TTN 突變可能是肺鱗狀細胞癌發的預后因素。本研究還發現原發性肝癌少見突變基因MYO18B 和CSMD1。Edakuni N等[11]研究表明MYO18B 的體內表達抑制SCID 小鼠中人惡性胸膜間皮瘤細胞的生長，提示MYO18B 具有腫瘤抑制作用。有研究表明[12]，CSMD1 基因缺失與乳腺癌、肺癌、前列腺癌和頭頸癌的發生發展有關。

已有許多基因檢測發現癌癥的發生是基因共同突變導致的，而不是單個基因決定的。本研究發現了原發性肝癌中存在多個突變共存的基因，同樣驗證了這一觀點。研究證明ADCYAP1 基因參與各種發育過程，并且發揮著神經激素、神經調節遞質、神經營養因子的作用[13]。此外ADCYAP1 基因調控大腦中谷氨酸能神經元[14]，與創傷后壓力綜合征有關[15]，該基因也是大腦壓力網絡中的重要組成部分[16]。因此，ADCYAP1 基因突變與MUC16 基因突變協同作用可能會促進肝癌細胞的遷移，促進腫瘤的發展。本研究中肝癌原發灶中的TTN 基因與ZNF208、ZDBF2、VCPIP1、USP34 基因存在強烈的突變共存現象并表現出相關性。有研究發現[17]，在肺鱗狀細胞癌患者中檢測到TTN 基因和TP53 基因突變共存，并且此類腫瘤患者顯示出更長的OS 和無病生存期，這表明TTN 基因和TP53 基因突變可能在肺鱗狀細胞癌中具有協同作用，可以預測良好預后。因此，TTN 也可能與上述共突變基因在原發性肝癌中協同作用。在原發性肝癌還發現MYO18B 基因發生了突變，并且與轉移灶中HHIPL2 基因存在強烈的突變共存現象以及相關性。但目前并未發現HHIPL2基因的過度表達與任何癌癥相關，其確切的生物學功能尚不清楚，考慮到HHIP1 基因與Hedgehog 信號通路的蛋白質相互作用，HHIPL2 基因參與癌癥的發生發展也可能與該通路有關[18]。因此，HHIPL2基因與MYO18B 基因在原發性肝癌中突變共存，可能與原發性肝癌的轉移有關。

RAS 信號通路與細胞的增殖與生長關系密切。有研究表明[19]，Ras/Raf/Mek/Erk 信號轉導通路廣泛參與肝癌細胞的生長、轉移等過程。目前，已有針對RAS 靶點的法尼基轉移酶抑制劑FTIs、針對B-Raf靶點的一代抑制劑索拉菲尼[20]上市。NOTCH 信號通路作用復雜，在單個腫瘤內可能同時具有致癌和抑癌的雙重作用[21]。因此，針對該通路還要進一步研究。Hippo 信號轉導通路失活時，可促進癌細胞存活、增殖、侵襲性遷移和轉移，該過程可見于肝癌、肺癌、結直腸癌等多種癌癥中，可導致化療、放療或免疫治療耐藥的發生[22]。本實驗結果還涉及了WNT[23]、PI3K[24]、TP53[25]、MYC[26]、NRF2[27]信號通路，但突變基因在這些通路中富集較少。

通過DGIdb 數據庫篩選出了原發灶和轉移灶共同的10 個藥物作用靶點。可成藥基因組是指編碼蛋白質、可用于藥物靶標的基因集，其包含的基因較多，如突變基因ABCA13、ABCC8、ARSK 等，這些基因編碼的蛋白質就可以針對腫瘤，確定藥物作用的正確位點。同樣，藥物作用靶點是絲氨酸/蘇氨酸激酶、離子通道、腫瘤抑制因子等的突變基因，也會因為氨基酸序列發生改變而影響藥物在人體代謝過程，從而對藥物與其作用靶點結合產生影響，最終影響藥物效應。可以在此基礎上將基因組與疾病關聯起來，尋找更多有意義的藥物作用靶點。

本研究尚存在不足，納入的病例數量有限，增加樣本數量，特別是發生遠端轉移患者的數據，將為原發性肝癌同時性轉移異質性研究提供參考。