癲癇患者單用奧卡西平時其活性代謝產物血藥濃度的影響因素分析*

黃 蕾，沈 凱，趙 誠，李文玲

南通大學附屬醫院 藥學部,南通226001

癲癇是一種以大腦皮質神經元高度同步化放電為基本病理生理基礎的慢性腦部疾病。我國癲癇的患病率達3.6‰～4.4‰，每年新增40 萬～60 萬例[1]。奧卡西平（oxcarbazepine）是一種前體藥物，本身無活性，口服后，在體內經過肝臟細胞迅速降解為活性代謝產物10，11-二氫-10-羥基卡馬西平（10，11-dihydro-10-hydroxycarbamazepine，簡稱10-羥基卡馬西平）而發揮抗癲癇作用。后者大部分通過弱誘導的微粒體二磷酸尿苷-葡萄糖醛酸轉移酶（uridine diphosphate -glucuronyltransferase，UDP -UGTs）轉化為葡萄糖醛酸酯結合物而經腎臟排出[2]。由于外周血中僅有少量的奧卡西平，而主要以10-羥基卡馬西平的形式存在，故臨床常以10-羥基卡馬西平的血藥濃度代替奧卡西平監測治療情況。

在奧卡西平治療癲癇患者的臨床實踐中發現，奧卡西平的每日維持劑量和10-羥基卡馬西平血藥濃度存在較大的個體間變異。通常，臨床予以初始劑量，依據患者的療效與毒性反應以及血藥濃度水平及時調整劑量。但在調整過程中，易發生癲癇發作未受控制而加劇病情，初始濃度過高導致藥物不良反應等問題。癲癇患者的非遺傳因素與遺傳因素都有可能是導致奧卡西平藥代動力學變異的重要因素。UGTs 酶是一個關鍵蛋白超家族，可使多種藥物葡萄糖醛酸化，而大部分10-羥基卡馬西平是通過肝臟中的UGTs 代謝的。肝細胞核因子4ɑ（hepatocyte nuclear factor4ɑ，HNF4ɑ）屬于核內激素超家族，在肝臟中高表達并廣泛參與肝臟發育、分化成熟的過程。此外，HNF4ɑ 通過調控UGTs、細胞色素P450（cytochrome P450，CYP450）和磺基轉移酶等基因而在藥物代謝控制中起關鍵作用。本研究結合患者的身高、體重、身體質量指數（body mass index，BMI）、年齡、性別、體表面積（body surface area，BSA）等方面研究其對10-羥基卡馬西平血藥濃度的影響，同時，分析UGT 家族中UGT1A9 I399 T ＞C（rs2741049）、UGT2B15 D85Y（rs1902023）的位點以及HNF4α 基因（rs2071197）位點的多態性與10-羥基卡馬西平血藥濃度的關系。

1 資料與方法

1.1 研究對象

納入2021 年10 月～2022 年8 月于本院就診的漢族癲癇患者共66 例。

納入標準：①經發作史、腦電圖、實驗室檢查等確診為癲癇的患者；②奧卡西平單藥治療；③肝腎功能正常。排除標準：①用藥依從性差、不配合隨訪的患者；②合并有其他嚴重疾病者；③妊娠期及哺乳期婦女。

1.2 給藥劑量與方法

門診與住院患者均予以奧卡西平（曲萊，諾華制藥，150mg/片）口服給藥，成人起始劑量300mg·d-1，分2 次口服給藥，逐漸加量至有效劑量維持。兒童（年齡＜18 歲）按照8～46mg·kg-1·d-1[3]，分2 次口服給藥。

1.3 血藥濃度檢測方法

連續服用奧卡西平3 d 以上的患者血藥濃度達穩態后，在次日服藥前取血。已有文獻報道[4-6]，檢測奧卡西平與其代謝物10-羥基卡馬西平的方法包括高效液相色譜法（HPLC）法和液相色譜-串聯質譜法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）法。本研究采用HPLC 法測定10-羥基卡馬西平的穩態血藥谷濃度。

色譜條件：色譜柱Angilent C18（150mm×4.6mm，5 μm）；流動相：25 mmol·L-1磷酸二氫納緩釋液:乙腈（70∶30）；檢測波長：210 nm；柱溫：30℃；進樣量：20 μL；流速：1 mL·min-1。

標準儲備溶液的配制：稱取10-羥基卡馬西平對照品（上海樂研公司，批號1100104，純度約98%）約10 mg，精密稱定，用1 mL 甲醇溶解，得10 mg·mL-1標準儲備溶液。以10-羥基卡馬西平高（80 μg·mL-1）、中（10 μg·mL-1）、低（2 μg·mL-1）3 個濃度為質控樣品。

血清樣本的處理：血漿樣本于4℃下以3500 r·min-1離心10min，精密吸取血清100μL，加入乙腈300μL，渦旋振蕩5min，以14000r·min-1離心10min；吸取上清液300 μL，以14 000 r·min-1離心5 min，取上清液200 μL 備用。

1.4 基因檢測

取EDTA 抗凝的全血樣品200 μL，按照Ezup柱式血液基因組DNA 抽提試劑盒說明書進行全基因組DNA 提取。DNA 質量檢測如下：①取5 μL DNA 溶液1%瓊脂糖、1×TAE 緩沖溶液電泳（電壓120～180 V）檢測，單一條帶說明DNA 完整無降解，有明顯的條帶說明濃度可以滿足PCR 要求；②分光光度計檢測濃度和純度，取1 μL 檢吸光度A，A260/280在1.7～2.0，說明DNA 質量較好，小于1.7 有蛋白污染，大于2.0 有RNA 污染。采用Primer Premier 5 軟件設計引物，見表1，一般參數如下：引物長度18～30 bp、Tm值55～65℃、退火溫度60℃左右、GC 含量40%～70%、位點測序引物150～300 bp 左右，離位點80～150 bp，外顯檢測引物離外顯子上下游150 bp左右、目的基因測序的PCR 產物條帶一般不超過1200bp。使用美國ABI 的PCR 儀，PCR 反應體系：1μL 模板DNA、10μmol·L-1引物F 1μL、10μmol·L-1引物R 1 μL、10 mmol·L-1Dntp（mix）1 μL、10X Taq Buffer（with MgCl2）2.5μL、5U·μL-1Taq 酶0.2μL、ddH2O 25 μL。PCR 反應條件：95℃預變性5 min、94℃變性30 s、63℃（每循環降0.5℃）退火30 s、72℃延伸30 s、10 個循環；95℃變性30 s、58℃退火30 s、72℃延伸30 s、30 個循環；72℃修復延伸10 min、4℃保溫。PCR 產物取5μL 以1%瓊脂糖凝膠電泳（150V、100 mA、10～20 min）分離。目的PCR 條帶切膠回收，在result group 中尋找結果，并使用Sequence analysis 軟件進行分析。

表1 引物序列

1.5 數據處理與統計分析

采用SPSS 26.0 統計分析軟件進行數據整理與分 析，Graghpad Prism 5 繪制圖形。通 過Kolmogorov-Smirnov 檢驗進行正態性驗證，符合正態分布的兩組間比較選用t 檢驗，不符合正態分布的采用Wilcoxon 秩和檢驗。對于相關性分析采用Pearson 和Spearman 相關性分析，以P ＜0.05 作為顯著性差異的標準。根據Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律，采用χ2檢驗進行分析，若P ＞0.05，則代表人群具有群體代表性。

2 結果

2.1 臨床相關因素與10-羥基卡馬西平血藥濃度的關系

納入的66 例患者均為奧卡西平單藥服用患者，且至少進行了一次血藥濃度監測。分別對給藥劑量、年齡、性別、身高、體重、BMI 和BSA 與10-羥基卡馬西平的血藥濃度進行相關性分析，各因素統計數據見表2，結果發現，給藥劑量與10-羥基卡馬西平血藥濃度呈正相關（P=0.000 4，r=0.455 6），見圖1；年齡、BSA、身高與10-羥基卡馬西平校正血藥濃度呈正相關，見圖2。

圖1 10-羥基卡馬西平血藥濃度與給藥劑量的相關性

圖2 10-羥基卡馬西平血藥濃度與變量間的相關性

表2 各因素統計數據

2.2 基因多態性對10-羥基卡馬西平血藥濃度的影響

根據Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律：UGT1A9（rs2741049）、UGT2B15（rs1902023）、HNF4α（rs2071197）3 個SNPs 的基因型進行卡方檢驗，結果顯示P ＞0.05，故該人群具有群體代表性，詳見表3。另外，為了探究基因多態性與10-羥基卡馬西平血藥濃度的關系，本研究將三個位點的不同基因型之間兩兩比較，結果發現UGT2B15（rs1902023）的CC 型與CA基因型間存在一定的差異（P=0.0348，t=2.185），見圖3。有研究發現[7]，UGT2B15 的表達呈現性別依賴性調控，為了排除其他因素影響，將兩組間的性別、年齡、身高、體重、BSA、BMI 進行了比較，結果顯示差異均無統計學意義（P ＞0.05）。

圖3 不同基因型與校正濃度logCDR 的相關性

表3 基因型分布情況

3 討論

奧卡西平是新一代廣譜抗癲癇藥，屬于無活性的前體藥物，通過肝臟的細胞溶質芳香酮基還原酶的作用，可快速轉化為有藥理活性的代謝產物10-羥基卡馬西平[8]。目前奧卡西平作為部分性發作的一線藥物，在兒童和成人癲癇患者中應用廣泛。已有研究證實[9]，單藥或聯用奧卡西平在治療兒童和成人部分性癲癇中都具有很好的有效性與安全性。關于體質量、性別、年齡、體表面積等因素與10-羥基卡馬西平血藥濃度的相關性研究也有少量發表，但是結論存在一定的差異。本研究發現年齡、身高、體表面積都與10-羥基卡馬西平血藥濃度存在一定的關系，這與Armijo JA等[10]的研究結果一致。但也有研究發現[11]，10-羥基卡馬西平的血藥濃度與年齡、體質量等并沒有相關性。兒童處于快速生長發育時期，隨著年齡增長，機體的代謝能力增強，而老年患者的代謝能力也逐漸減弱，所以年齡在一定程度上也反映了肝腎功能、體質量及局部血流灌注情況。而0～5 歲兒童的肝臟質量、體質量和血流水平較大齡兒童和成人要高得多，其代謝能力反而相對較高[12]。有文章報道[13]，6 個月至青春期的嬰幼兒和兒童，其肝臟的代謝酶活性約為成人的2 倍；2～6 歲兒童的腎臟清除率約為成人的2倍[14]；而老年患者奧卡西平的清除率降低[15]。因此，有必要對使用奧卡西平的癲癇患者進行血藥濃度監測。在針對兒童患者奧卡西平血藥濃度影響因素的相關研究中，不同研究結果也存在一定差異，有研究表明性別、年齡與10-羥基卡馬西平血藥濃度無關[16]。同樣，在另一項對217 例患兒10-羥基卡馬西平的血藥濃度研究[17]和Park KJ等[11]的研究也顯示無統計學意義。但也有研究[18]表明10-羥基卡馬西平的血藥濃度與年齡和性別有關。導致上述研究結果差異的可能原因有不同研究樣本量大小的不同、患者存在地域種族差異以及年齡分層等。本研究納入的患者均為華東地區漢族人群，為了更好地了解華東漢族人群10-羥基卡馬西平的血藥濃度，還需進一步開展更大樣本量的研究。

此外，奧卡西平的代謝和治療效果可受到代謝酶、轉運體和靶點的影響。有研究指出[19]，10-羥基卡馬西平可分為S-型和R-型，比例約為4∶1，其中S-型葡萄糖醛酸化代謝酶是葡萄糖醛酸轉移酶2 家族B15（UGT2B15），R-型則是葡萄糖醛酸轉移酶1 家族A9（UGT1A9）和2 家族B7（UGT2B7）。UGTs 介導的葡萄糖醛酸化是人類以及其他哺乳動物中消除異生物和內生化合物的重要代謝途徑[20]。人體內藥物和內源性化合物的葡萄糖醛酸化速率存在個體間差異，因此同一藥物在不同個體間的藥物治療量和毒性劑量有所差異，同樣，疾病的易感風險也會存在個體差異。各種因素可能會導致葡萄糖醛酸化的變異性，包含了遺傳多態性和由酶誘導或抑制而導致的藥物間的相互作用[21]。近年來，UGTs 中超過200 個等位基因的多態性已被研究出對酶功能、細胞運輸和基因表達具有特殊影響，進而影響藥物在體內的作用[22]。過往研究表明[23-25]，亞洲人中的UGT1A4 142 T ＞G、UGT1A6 19 T＞G、UGT1A9 I399 C ＞T、和UGT2B15 253 T＞G 的等位基因頻率高于其他人種。

本研究發現，10-羥基卡馬西平的血藥濃度在UGT2B15 rs1902023 不同基因型之間存在一定的差異，CC 型患者的血藥濃度低于CA 型。相關研究報道較少，而UGT2B15 最初被認為在雄激素類固醇、藥物代謝和其他異種生物制劑的葡萄糖醛酸化過程中起著重要作用[26]。此外，本研究并未觀察到UGT1A9 rs2741049 與10-羥基卡馬西平血藥濃度間顯著相關性，考慮到不同研究群體的局限性，仍需要進一步研究。同樣，本研究結果顯示HNF4α rs2071197 的多態性與10-羥基卡馬西平血藥濃度無關，這提示HNF4α rs2071197 基因的多態性可能不參與奧卡西平單藥治療的癲癇患者中奧卡西平的代謝與轉運。

本研究也有一定局限性，多種因素可能影響10-羥基卡馬西平的血藥濃度，如其他SNPs 可能的影響。由于單獨使用奧卡西平治療的癲癇患者樣本量較小，有待于更大樣本、多中心聯合的進一步研究，以及不同種族、不同年齡段的細分。本研究表明了10-羥基卡馬西平血藥濃度與年齡、BSA、身高存在一定的關系，另外，UGT2B15 rs1902023 不同基因型間與10-羥基卡馬西平的血藥濃度相關，這可能有利于臨床醫師在觀察臨床癥狀的同時，結合血藥濃度結果，制定出符合個體特點的給藥方案，提高有效性和安全性。