HPLC法測定艾拉戈克鈉原料藥中手性異構(gòu)體的研究

張高雅，厲廷有*，田帥華，劉紅偉，何蘇云

1南京醫(yī)科大學 藥學院,南京 211166;2江蘇奧賽康藥業(yè)有限公司,南京211112

艾拉戈克鈉（elagolix，商品名Orilissa?）是由美國艾伯維公司研發(fā)并于2018 年經(jīng)FDA 批準上市的小分子促性腺激素釋放激素（gonadotropin-releasing hormone，GnRH）受體拮抗劑，用于治療子宮內(nèi)膜異位癥引發(fā)的中度和重度疼痛[1，2]。艾拉戈克鈉通過與垂體中的GnRH 受體競爭性結(jié)合，抑制內(nèi)源性GnRH 信號傳導(dǎo)，可減少卵巢性激素的分泌，達到治療子宮內(nèi)膜異位癥的目的[3，4]。相關(guān)臨床試驗表明[5]，艾拉戈克鈉可顯著改善由于子宮內(nèi)膜異位癥引發(fā)的痛經(jīng)和非經(jīng)期疼痛，連續(xù)使用6 個月，可降低患者子宮內(nèi)膜厚度。此外，艾伯維公司公布的Ⅲ期臨床數(shù)據(jù)顯示，艾拉戈克鈉在治療子宮肌瘤引發(fā)的月經(jīng)大出血方面也具有良好的療效[6]。

艾拉戈克鈉化學名為4-（{（1R）-2-[5-（2-氟-3-甲氧苯基）-3-{[2-氟-6-（三氟甲基）苯基]甲基}-4-甲基-2，6-二氧代-3，6-二氫嘧啶-1-基]-1-苯乙基}氨基）丁酸鈉[3]，具有一個手性中心，應(yīng)對其手性異構(gòu)體進行限度控制（圖1）。目前國內(nèi)外未見關(guān)于艾拉戈克鈉手性異構(gòu)體研究的相關(guān)文獻，鑒于此，本研究建立了艾拉戈克鈉原料藥中手性異構(gòu)體的高效液相色譜檢查法（HPLC），以期為該藥品質(zhì)量控制提供參考。

圖1 艾拉戈克鈉（A）及其手性異構(gòu)體（B）結(jié)構(gòu)式

1 儀器與材料

1.1 儀器

LC-20AT 高效液相色譜儀（日本島津公司）；XSE205DU 電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司，十萬分之一）。

1.2 試劑

甲醇、乙腈（色譜純，北京百靈威）；甲酸、二乙胺（分析純，南京化學試劑有限公司）；艾拉戈克鈉手性異構(gòu)體對照品（批號S19121204，含量96.6%）、艾拉戈克鈉對照品（批號S20022401-3，含量98.4%）、艾拉戈克鈉樣品（批 號S20071502、S20112701、S20092702-3）均購自江蘇奧賽康藥業(yè)有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

CHIRALPAK ZWIX（-）（4 mm×150 mm，3 μm）色譜柱（硅膠表面共價鍵合-奎寧（8R，9S）-（1R，2R）-環(huán)己基氨基磺酸衍生物）；甲醇-乙腈-水-甲酸-二乙胺（170∶810∶20∶0.38∶0.52）流動相；流 速0.5 mL·min-1；運行時間20 min；檢測波長270 nm；柱溫25℃；自動進樣盤溫度5℃；進樣量10 μL。

2.2 溶液制備

對照品溶液：取艾拉戈克鈉異構(gòu)體對照品適量，精密稱定，加乙腈溶解并定量稀釋制成濃度為5 μg·mL-1的溶液。

系統(tǒng)適用性溶液：取艾拉戈克鈉對照品適量，精密稱定，加異構(gòu)體對照品溶液溶解并定量稀釋制成艾拉戈克鈉濃度為1 mg·mL-1、艾拉戈克鈉異構(gòu)體濃度為5 μg·mL-1的混合溶液。

供試品溶液：取艾拉戈克鈉樣品（批號S20071502）適量，精密稱定，加乙腈溶解并定量稀釋制成濃度約為1 mg·mL-1的溶液。

2.3 專屬性試驗

精密量取供試品溶液、對照品溶液、系統(tǒng)適用性溶液及乙腈各10 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，見圖2。艾拉戈克鈉及其手性異構(gòu)體的保留時間分別約為7.2 min 和9.3 min，兩色譜峰分離度約為4.0，理論塔板數(shù)均大于3000，乙腈無干擾，表明該方法專屬性良好。

圖2 專屬性試驗HPLC 圖譜

2.4 定量限和檢測限的測定

艾拉戈克鈉異構(gòu)體的檢測限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantitation，LOQ）按“2.1”項下色譜條件，根據(jù)信噪比法用乙腈逐級稀釋對照品溶液進行測定。結(jié)果測得艾拉戈克鈉異構(gòu)體的LOQ（信噪比為10∶1）約為0.25 μg·mL-1，LOD（信噪比為3∶1）約為0.1 μg·mL-1。

2.5 線性關(guān)系考察

取艾拉戈克鈉異構(gòu)體對照品適量，精密稱定，加乙腈溶解并定量稀釋制成濃度分別2.5、4.0、5.0、7.5 和10 μg·mL-1的系列艾拉戈克鈉線性試驗溶液，按“2.1” 項下色譜條件，精密量取線性試驗溶液和“2.3”項下LOQ 溶液各10 μL 進樣分析，記錄譜圖。以峰面積響應(yīng)（Y）為縱坐標，質(zhì)量濃度（X，μg·mL-1）為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=0.422 9X-0.136 6（r=0.999 1），在0.25～10 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6 溶液穩(wěn)定性

按“2.2”項下方法配制系統(tǒng)適用性溶液、對照品溶液和供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12、24 h 取樣，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄艾拉戈克鈉異構(gòu)體峰面積。結(jié)果表明，系統(tǒng)適用性溶液艾拉戈克鈉異構(gòu)體峰面積RSD 為1.3%，對照品溶液峰面積的RSD 為0.81%，供試溶液均未檢出艾拉戈克鈉異構(gòu)體。確證系統(tǒng)適用性溶液、對照品溶液和供試溶液在5℃條件下保存穩(wěn)定性良好。

2.7 回收率實驗

取艾拉戈克鈉異構(gòu)體對照品適量，精密稱定，加乙腈溶解并定量稀釋制成濃度為25 μg·mL-1的對照品貯備液。精密量取對照品貯備液，加乙腈稀釋10 倍制備定量限貯備液。另取本品約10 mg，精密稱定，置10 mL 量瓶中，平行配制12 份，分為4組，第1 組分別精密加入定量限貯備液1 mL，第2～4 組分別精密加入對照品貯備液1、2、4 mL，再分別加乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，按“2.1”項下色譜條件進行測定。結(jié)果見表1。

表1 異構(gòu)體檢查回收率試驗結(jié)果

結(jié)果表明，測得不同限度水平艾拉戈克鈉異構(gòu)體的加樣回收率在94.33%～109.1%之間，RSD ＜10%，方法回收率良好。

2.8 精密度實驗

2.8.1 進樣精密度試驗 精密量取“2.2”項下對照品溶液10 μL，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。連續(xù)進樣6 次，考察方法的進樣精密度。結(jié)果表明，艾拉戈克鈉異構(gòu)體峰面積RSD 為0.84%，方法進樣精密度良好。

2.8.2 加標重復(fù)性試驗 按“2.7”項下0.5%限度水平配制回收率溶液，平行6 份。按“2.1”項下色譜條件測定，采用外標法計算異構(gòu)體含量，見表2。

表2 異構(gòu)體檢查加標重復(fù)性試驗結(jié)果

2.9 耐用性實驗

精密量取對照品溶液和系統(tǒng)適用性溶液各10 μL，分別進樣，考察柱溫、流速、波長以及流動相組成等微小變動對檢查結(jié)果的影響。結(jié)果表明，上述條件發(fā)生微小變化時，對異構(gòu)體的檢出量和分離度均無明顯影響，方法耐用性良好，見表3。

表3 異構(gòu)體檢查耐用性實驗結(jié)果

2.10 樣品測定

取3 種不同批次艾拉戈克鈉原料藥（批號S20071502，S20112701，S20092702-3）及其影響因素試驗（5、10、30 d）樣品，按“2.2”項下供試品溶液方法配制該批次樣品溶液及對照溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，采用外標法計算各批次異構(gòu)體含量，結(jié)果均未檢出異構(gòu)體雜質(zhì)。

3 討論

本研究建立了測定艾拉戈克鈉原料藥中艾拉戈克鈉手性異構(gòu)體的HPLC 方法，使用兩性離子交換柱進行分離。該方法專屬性強、靈敏度高、準確性好，可對艾拉戈克鈉原料藥中的艾拉戈克鈉異構(gòu)體含量進行準確測定，為確保藥品質(zhì)量提供了重要的依據(jù)。

本研究進行色譜柱篩選時，首先考慮正相色譜使用手性柱進行實驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正相色譜的手性柱色譜圖出現(xiàn)比例約為1∶1 的雙色譜峰，且峰形較差，推測是艾拉戈克鈉及其異構(gòu)體存在旋阻異構(gòu)造成的結(jié)果。艾拉戈克鈉化學結(jié)構(gòu)中含有一個仲胺和一個羧基基團，其結(jié)構(gòu)與氨基酸較為類似，嘗試使用兼容反向色譜的兩性離子交換柱進行分離。采用日本DAICEL 公司開發(fā)的CHIRALPAK ZWIX 離子交換色譜柱，通過鍵合具有手性結(jié)構(gòu)的奎寧衍生物，達到對兩性手性氨基酸分離的目的。結(jié)果表明用該色譜柱分離艾拉戈克鈉及其異構(gòu)體效果良好。CHIRALPAK ZWIX 具有（+）和（-）兩種類型，其鍵合的奎寧衍生物的手性碳手性構(gòu)型相反，嘗試用兩種類型色譜柱進行分離，使用CHIRALPAK ZWIX(+) 柱其空白溶劑在異構(gòu)體峰處有干擾，因此選擇CHIRALPAK ZWIX（-）柱進行檢測。

參考DAICEL 公司關(guān)于CHIRALPAK ZWIX（-）柱的說明書，其流動相含有20%左右的甲醇以提供質(zhì)子。同時作為離子交換柱，流動相中應(yīng)添加適當?shù)乃釅A添加劑組合以促進待分離物的解離，推薦使用甲酸-二乙胺（摩爾比2∶1）作為離子對添加到流動相中。甲醇比例過高，雖然會達到更好的分離效果，但其保留時間也會相應(yīng)縮短，耐用性的考察結(jié)果也證明了這一點。在選擇20%以上甲醇比例的流動相時，艾拉戈克鈉及其異構(gòu)體的保留時間出現(xiàn)明顯下降。為保證艾拉戈克鈉峰能在色譜柱中適宜的保留和方法耐用性，最終優(yōu)化確定甲醇占比為17%流動相甲醇-乙腈-水-甲酸-二乙胺比例（170∶810∶20∶0.38∶0.52）進行測定。

對艾拉戈克鈉及其異構(gòu)體的對照品進行190～400 nm 全波長掃描，均在270 nm 附近有特征吸收（圖3），為了避免流動相本底干擾，選擇此波長進行檢測。

圖3 全波長掃描圖