電子束對體外培養的細粒棘球蚴及其p38 mRNA 表達的影響

楊麗萍 路鵬霏 周 欽 古麗米來·玉素甫 吾日古麗·巴吾東 毛 睿

新疆醫科大學第一附屬醫院腫瘤中心（烏魯木齊 830000）

棘球蚴病俗稱包蟲病，是由棘球蚴絳蟲的中絳期幼蟲寄生于人體及其余動物所引起的一種人畜共患性疾?。?］。據估計因棘球蚴病導致全球畜牧業每年損失約20億美元，人類因棘球蚴病的死亡率為2%～4%［2］。手術是治療細粒棘球蚴病的首選方法，但術后復發率極高。近幾年，國內外對甲苯達唑、阿苯達唑［3］等藥物的治療療效、藥理學等方面都做了深入的研究［4-6］。其臨床療效不甚理想，治愈率只有30%。因外科手術清除難度大、高復發率及藥物療效欠佳，對于棘球蚴病的治療仍需尋求新的方式。目前已證實放射治療對棘球蚴有明顯的殺傷作用，且放射療法的安全性相對較高，并有獨特的形態學和結構組織的改變［7-9］。

放射治療主要分為外照射和近距離放射治療兩種技術，外照射包括低能X線、電子束，有研究證實X線對棘球蚴病的治療有效［10］，由于電子束對較表淺組織的照射有更高的控制率，有更好的劑量分布，且目前暫無電子束照射棘球蚴的相關研究，所以本研究采用電子束進行實驗。有研究發現，在細粒棘球蚴原頭蚴中有相應的p38基因信號通路，p38基因是由Brewster等［11］研究發現，它與寄生蟲的生長、繁殖信號傳遞過程密切相關［12-16］，且在棘球蚴中較高表達［17-20］，已有結論證實p38抑制劑可抑制體外培養的棘球蚴生長［21-22］，Gelmedin等提到［23］應用基因抑制劑處理，可將體外培養的棘球蚴的p38基因信號通路阻斷，并使蟲體死亡率明顯升高；Schiff 等［24］發現p38的基因有助于放療后的細胞修復，證實p38基因可能會減弱放療療效。本研究通過電子束照射棘球蚴，觀察蟲體大體結構、死亡率的變化并檢測其中p38基因的表達情況，進一步了解電子束對于棘球蚴的殺傷作用及p38基因在其中的作用機制，以期探索包蟲病潛在治療靶點，提供新的治療路徑。

1 材料與方法

1.1 棘球蚴來源

本研究用于體外培養的棘球蚴來自自然感染棘球蚴的綿羊肝臟，由新疆維吾爾自治區烏魯木齊市畜牧站提供。研究方案通過新疆醫科大學實驗動物倫理審查（倫理學審批號：IACUC-20141021002）。

1.2 主要試劑

磷酸鹽緩沖液（PBS）；培養'基：RPMI 1640培養基、含有100 U/mL的青霉素及100 μg/mL鏈霉素的雙抗、胎牛血清；含有1%胃蛋白酶的消化液；0.1%的亞甲基藍染色劑；Trizol；氯仿；異丙醇；DEPC水；無水乙醇等。

1.3 原頭蚴分離

抽取羊肝包囊內液體至50 mL培養管中，將棘球蚴沉淀置于消化液中，并于37 ℃水浴30 min，每隔5 min觀察消化情況，無明顯可見囊皮，停止胃蛋白酶消化過程，消化完畢后檢測原頭蚴的活性。

1.4 原頭蚴活性觀察及計數

吸取1 μL蟲體至EP管中，進行染色，用PBS沖洗染液，用光鏡觀察原頭蚴活性、數量等，重復4～5次得均值，以此估算蟲體總數。

1.5 原頭蚴體外培養

將含有胎牛血清、RPMI 1640培養基、100 IU/mL的青鏈霉素雙抗的培養液稀釋細粒棘球蚴原頭蚴至2 000粒/mL，移置于培養瓶中，共分為同等的3瓶，在37 ℃、含有5% CO2的培養箱中培養，需每2～3天更換一次更換培養液，注意實驗開始前，細粒棘球蚴原頭蚴的培養時間不宜超過3 d。

1.6 原頭蚴電子束照射

用0 Gy、30 Gy、60 Gy的6 兆電子束（6 MeV）分別對各分組培養瓶進行1次放射，將放射后的培養瓶繼續放置于培養箱中連續培養3 d、14 d，以上實驗步驟共進行3～4次的重復實驗。

1.7 原頭蚴RNA的提取

準備實驗所需試劑及實驗設備，按照RNA提取步驟進行RNA的提取。

1.8 逆轉錄、qRT-PCR及檢測原頭蚴p38基因表達

mRNA的逆轉錄合成cDNA：按照TaKaRa公司的反轉錄試劑盒進行逆轉錄操作；進行qRT-PCR反應，引物序列見表2。

表2 p38 基因qRT-PCR引物序列信息

用cDNA作為模板，按照德國QIAGEN公司的QuantiNova SYBR Green PCR Kit（Perfect Real Time）說明書進行操作，測定p38 基因的表達，并以β-actin作為內參，反應體系為20 μL，見表3。

表3 p38基因qRT-PCR反應體系

每個樣本設置三個重復實驗，包括 1 次陰性對照，反應條件按照說明書進行設置。計算過程：選擇每個孔的Ct值，依照相對定量公式 2-△△Ct，即△Ct=Ct（p38）-Ct（β-actin），△△Ct=△Ct（實驗組）-△Ct（對照組），統計分析選擇單因素方差分析，得出p38基因的mRNA 相對表達量。

1.9 統計學分析

采用Prism 8.0與SPSS 26.0統計軟件，所有實驗需要包含不得少于3次的重復實驗，數據表示為均值±標準差（±s），蟲體死亡率的比較采用χ2檢驗，qRT-PCR測得mRNA表達量的比較采用方差分析和SNK法進行兩兩比較，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 電子束照射對原頭蚴的狀態及形態結構的影響

相同劑量電子束照射的蟲體結構在不同天數（3 d、14 d）時無明顯差異，0 Gy組蟲體活性基本正常，形態結果未見明顯改變；30 Gy照射劑量分組中部分蟲體活力減弱，育囊減少，部分囊壁變薄、塌陷；60 Gy照射劑量分組中蟲體體積縮小明顯，正常形態消失，多呈不規則球形、勾突脫離、頭節裂解、吸盤扭曲（見圖1）。

圖1 光鏡下觀察各組細粒棘球蚴原頭節形態結構

2.2 電子束照射對原頭蚴死亡率的影響

經卡方檢驗證實部分分組死亡率有統計學意義（P＜0.05），對以上實驗數據進行兩兩比較，見表1。

表1 單純照射組細粒棘球蚴原頭節死亡率差異情況

培養3 d、14 d時0 Gy組30 Gy、60 Gy組細粒棘球蚴原頭節的死亡率有差異（P＜0.012 5）；30 Gy與60 Gy組的細粒棘球蚴原頭節死亡率也有差異（P＜0.012 5）；相同照射劑量下培養3 d與培養14 d時的死亡率未見差異（P＞0.012 5）。

2.3 電子束照射對原頭蚴p38 mRNA表達的影響

經qRT-PCR檢測，在照射組細粒棘球蚴原頭蚴中的60 Gy組培養3 d時p38 mRNA表達其相對表達為：31.05±0.30，60 Gy組培養14 d時p38 mRNA表達其相對表達為：32.11±0.32，本研究證實照射組細粒棘球蚴原頭蚴中的電子束劑量為60 Gy組的p38mRNA的相對表達水平高于0 Gy及30 Gy組的相對表達水平（P ＜0.05），且培養3 d與14 d無差異（P＞0.05）。見圖2。

圖2 各組細粒棘球蚴原頭節經照射后qRT-PCR 測得mRNA 表達結果與平均死亡率對照

3 討 論

棘球蚴病是一種全球流行的動物源性寄生蟲?。?5］，寄生于人及某些動物等中間宿主中引起囊性棘球蚴病，如果不及時治療，90%的病例會在診斷后10～15年內死亡［26］。全世界每年估計有超過18 000例新病例，其中91%發生在中國［27］。棘球蚴病的治療選擇很少，手術治療主要在感染的早期階段，可進行預防性抗寄生蟲藥物治療［28］，外科手術及新型藥物治療都已經有了極大的突破［29］，但外科手術后的高復發率未得到有效解決，藥物治療中的耐藥機制的產生還未明確，因此我們對于細粒棘球蚴病的治療還在探尋更多、更新的治療方式。

本研究顯示，照射組在相同照射劑量下的連續培養3 d、14 d蟲體結構無明顯差異，0 Gy組蟲體形態飽滿，勾突、頭節、吸盤清晰可見，大部分有活動性且不被藍染著色；30 Gy照射劑量分組表現為部分蟲體正常形態消失，部分藍染，活力減弱，育囊減少，部分囊壁變薄、塌陷、曲折斷裂；60 Gy照射劑量分組中鏡下觀察發現藍染著色細胞布滿大部分視野，蟲體正常形態消失，體積縮小明顯呈不規則球形、吸盤扭曲、頭節裂解，勾突脫離，棘球蚴囊壁可見毛刺狀破裂、塌陷，觀察60 Gy照射劑量分組中細粒棘球蚴原頭蚴細胞質散亂，腫脹變粗、擁擠。由此證實照射劑量為30 Gy、60 Gy的電子束對細粒棘球蚴原頭蚴均有殺傷作用，但60 Gy組殺傷作用更加明顯，而照射后培養天數的延長并不會影響蟲體死亡率的變化。

本研究發現，p38基因在受電子束照射的細粒棘球蚴原頭蚴中呈不同程度的表達水平，通過qRT-PCR檢測證實p38基因在60 Gy照射劑量分組中的相對表達水平高于0 Gy組及30 Gy組的相對表達水平，表明照射劑量的不同可能影響p38基因的表達變化。p38基因存在于所有真核生物中，其結構和調控特征從微生物到人類都是保守的，與其他MAPK 家族成員不同，p38基因通常不主動進行有絲分裂，而是被細胞異常微環境及炎癥信號激活，其編碼的蛋白質將信號從細胞膜傳遞到細胞核，以響應各種外源性和內源性刺激［30］。這與細粒棘球蚴接受電子束照射刺激后引起p38基因不同程度表達的理論相一致。p38基因信號通路的傳導引起相關通路的負反饋調節，可以起到抑制放射線誘導細胞凋亡的作用［31］。本研究顯示經電子束的照射使蟲體的死亡率升高、p38基因的表達增加，但p38基因的放療抑制作用可能不足以完全抵抗電子束對蟲體的殺傷作用，從而使電子束引起蟲體的生長阻滯，從而促進了棘球蚴蟲體的死亡，并且在60 Gy照射劑量下蟲體死亡率最高、p38基因的表達最高，這也為后期包蟲病的放射治療的劑量選擇提供一定的理論參考。

綜上所述，電子束治療包蟲病的研究目前仍處于初級階段，后期將進一步從機制出發，深入研究電子束致棘球蚴中p38基因信號通路調控變化的作用機制，為包蟲病的放射治療提供更多的實驗數據與理論支持。