HPLC 法分析奶茶中的咖啡因含量

◎ 梁遠祥

（廣西職業技術學院，廣西 南寧 530227）

咖啡因又稱咖啡堿，過量攝入會對機體產生嚴重損害[1]。作為一種食品添加劑，咖啡因在各類食品中的含量一直是食品檢測工作的重點。奶茶兼具牛奶和茶的雙重營養，深受廣大消費者的歡迎，特別是年輕的消費群體[2]。

對咖啡因毒理學研究的綜述中提出，咖啡因能夠誘導中樞神經系統發生紊亂。隨著快速消費品、茶飲等行業的發展，咖啡因成為人們日常使用最多的物質[3]。研究結果發現，咖啡因被人們大劑量或長期食用會對人體產生許多不良影響，尤其是對特殊人群（如兒童、青少年）[4]。因此，探索一種快速檢測奶茶中的咖啡因含量的方法十分重要。本文在已有研究的基礎上，提出了一種快速測定奶茶中咖啡因的方法，可用于樣品的日常測定。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Ultimate3000 高效液相色譜儀（賽默飛公司）；E201 型紫外-可見分光光度計（賽默飛世爾上海）；AB135-S 型電子天平（瑞士梅特勒托利多）；Milli Q超純水器（美國Millipore 公司）；KQ5200FB 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；咖啡因對照品來源中國食品藥品檢定研究院。

水為Minipore 超純水機制備的一級水；甲醇、乙腈購自天津永大化學試劑有限公司。

1.2 樣品來源

奶茶樣本源于市面，選取市面上銷售的常見品牌的5 個批次奶茶進行咖啡因含量測定。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品的制備

取樣品奶茶0.1 g，置于100 mL 容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度線，搖勻，過0.22 μm 濾膜，等待HPLC 分析。

1.3.2 對照品標準貯備液的制備

精密稱取咖啡因對照品20 mg，至20 mg容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度線即得咖啡因對照品標準貯備液，其濃度約為1.0 mg·mL-1。

1.3.3 檢測波長的選擇

取咖啡因對照品標準貯備液1 mL，至100 mg 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度線即得咖啡因對照品標準溶液，濃度約為10 μg/mL。對190 ～400 nm 波長范圍內的咖啡因對照品標準溶液進行掃描，波長掃描結果顯示咖啡因最大吸收波長為275 nm。因此，選擇275 nm 作為咖啡因含量測定方法的檢測波長。

1.3.4 流動相比例的選擇

選擇甲醇—水為體系作為流動相，取咖啡因對照品標準溶液（10 μg·mL-1）分別在甲醇：水為30:70、50:50、70:30 條件下進行分析，并對分析結果進行了對比。結果顯示，選擇甲醇：水為70:30 時，咖啡因出峰時間為3.5 min。選擇甲醇：水為50:50 和30:70 時，空白溶劑均不會對咖啡因色譜峰產生干擾。咖啡因出峰時間分別為7.9 min 和19.2 min，為減少分析時間，選擇甲醇：水為50:50 作為本實驗流動相。

1.3.5 主要儀器參數

色譜條件：色譜柱選擇Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；流速：1 mL·min-1。流動相：甲醇和水。洗脫程序見表1。

1.3.6 標準曲線的繪制

精密量取咖啡因對照品標準貯備液0.1 mL、0.25 mL、0.5 mL、0.75 mL、1.0 mL、2.0 mL，分別至100 mL 容量瓶中，用甲醇分別定容至刻度線，即 得 濃 度 分 別 為1 μg·mL-1、2.5 μg·mL-1、5μg·mL-1、7.5 μg·mL-1、10 μg·mL-1、20 μg·mL-1的標準曲線系列溶液。分別精密量取各標準曲線系列溶液各10 μL，在擬定的液相色譜條件下進樣分析，記錄峰面積[5]。以咖啡因的濃度為橫坐標，其峰面積為縱坐標進行線性回歸，獲得標準曲線。

1.3.7 咖啡因的檢測限與定量限

取咖啡因對照品標準溶液（10 μg·mL-1）在擬定的色譜條件下進行分析，根據分析結果逐級稀釋樣品濃度，分別測定咖啡因的檢測限（S/N=3）和定量限（S/N=10）。

1.3.8 樣品中咖啡因的加標回收率測定

取樣品奶茶0.1 g，置于100 mL 容量瓶中，分別加入咖啡因對照品標準貯備液0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL，加水溶解并稀釋至刻度線，搖勻，過0.22 μm 濾膜，待HPLC 分析。

1.3.9 樣品中咖啡因的測定

取樣品奶茶0.1 g，置于100 mL 容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度線，搖勻，過0.22μm 濾膜，在擬定色譜條件下進行分析，測定樣品中的咖啡因含量。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的測定結果

不同濃度咖啡因對照品的峰面積測定結果見表2，標準曲線見圖1。在擬定的色譜條件下，咖啡因在1.5 μg·mL-1～20μg·mL-1范圍內，線性方程為y=74.631x-18.575，R2=0.999 4。

圖1 標準曲線圖

表2 標準曲線數據表

2.2 標準曲線的測定結果

咖啡因的檢測限（S/N=3）為0.05 μg·mL-1，定量限（S/N=10）為0.15 μg·mL-1。

2.3 樣品中咖啡因的加標回收率測定結果

咖啡因的加標回收率結果見表3，結果顯示本方法測定咖啡因的加標回收率在98.63%～100.59%范圍內，9 份樣品測定結果的RSD 值為0.66%，本方法測定樣品中咖啡因準確度良好。

表3 樣品中咖啡因的加標回收率測定結果表

2.4 樣品中咖啡因的測定結果

對5 種不同市售奶茶中的咖啡因進行測定，結果見表4。

表4 5 種不同市售奶茶中的咖啡因測定結果表

從表4 的測定結果可以看出，5 種市售奶茶中的咖啡因含量存在不同差異，其中含量最高的奶茶中咖啡因含量為1 217.6 μg·g-1。咖啡因作為奶茶中含有的重要生物堿，其能夠解乏、興奮神經、促進血液循環，但大劑量或長期服用會損害人體健康，有成癮性。

3 結論

本文提出了液相色譜法測定奶茶中咖啡因的定量分析方法。通過對定量分析方法進行驗證，得到以下結論：通過紫外-分光光度法選擇275 nm 作為檢測波長；對流動性比例進行了優化，最終選取了甲醇:水（50:50）為流動相；提出了測定奶茶中咖啡因含量的標準曲線法進行定量分析，咖啡因在1.5 ～20 μg·mL-1范圍內，線性方程為y=74.631x-18.575，R2=0.999 4；檢測限為0.05 μg·mL-1，定量限為0.15 μg·mL-1；方法回收率為98.63%～100.59%，相對標準偏差為0.66%。本方法簡單快捷，靈敏度和準確度均較高，重復性好，研究結果對奶茶中咖啡因的快速檢測和質量控制具有重要意義。