星點(diǎn)設(shè)計(jì)響應(yīng)面法優(yōu)化白木香葉黃酮類化合物提取工藝

◎ 李俊毅，黃 忻，吳漫曄，黃乾峰，倪少義 ，陳麗玲，吳道偉，王偉斌，林昭亮

（1.揭陽(yáng)市食品檢驗(yàn)所，廣東 揭陽(yáng) 522000；2.揭陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東 揭陽(yáng) 522000）

白木香是瑞香科，沉香屬的喬木，別稱沉香、土沉香、牙香樹(shù)等，作為我國(guó)珍貴藥用植物主要分布于我國(guó)海南、云南、福建、兩廣等地[1]。國(guó)產(chǎn)中藥沉香，是其樹(shù)木生長(zhǎng)過(guò)程中受蟲(chóng)蛀、刀斧雷劈、獸咬等外界刺激，樹(shù)體表面損壞后自我修復(fù)時(shí)，被真菌寄生所堆積形成的香脂，可以入藥。白木香葉為沉香的非藥用部分，依據(jù)文獻(xiàn)[2]，白木香葉茶具有促進(jìn)小腸蠕動(dòng)、安神助眠、益氣益精等保健功效，白木香葉主要活性成分之一是黃酮類化合物[3]，具有抗氧化、抗炎、降血脂、抑菌、提高免疫力等作用。廣東省是白木香的重要產(chǎn)區(qū)，白木香葉產(chǎn)量高，具有廣闊的發(fā)展前景。然而，目前對(duì)白木香葉中黃酮類化合物提取工藝的研究尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本文以廣東揭陽(yáng)普寧產(chǎn)的白木香葉為原料，以白木香葉黃酮類化學(xué)成分為研究對(duì)象，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)響應(yīng)面法對(duì)其提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，為白木香葉產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)和資源利用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

白木香葉取自2020年12月廣東省揭陽(yáng)市普寧普僑區(qū)，經(jīng)廣東省揭陽(yáng)市中醫(yī)院主任中藥師楊曉平鑒定為瑞香科沉香屬白木香的葉，粉碎備用。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：HPLC ≥98%，源葉生物，批號(hào)：Y24F11Y17051；NaOH：分析純，廣州化學(xué)試劑廠；NaNO2：分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；Al（NO3）·9H2O：分析純，上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

中藥材粉碎機(jī)：SF130，福州法莫優(yōu)科；電子分析天平：十萬(wàn)分之一，BT 125D，德國(guó)賽多利斯；電子分析天平：萬(wàn)分之一，F(xiàn)A2004，舜宇恒平儀器；紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)：UV-1800，島津；恒溫水浴鍋：HH-ZK4，上海昆聚儀器設(shè)備有限公司。

1.3 黃酮類化合物測(cè)定方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

精密稱定蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，加入50 mL 80%的乙醇，配制0.2 mg·mL-1的貯備液，移液管分別移取1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL 該溶液于10 mL 具塞試管中，加入蒸餾水至5 mL，采用硝酸鋁顯色法[4-8]，分別向其中加入5% 亞硝酸鈉0.5 mL，靜置6 min，再加入10%硝酸鋁0.5 mL，再放置6 min，接著向其中加入1 mol·L-1氫氧化鈉4.0 mL，靜置15 min。同時(shí)用蒸餾水代替蘆丁試劑做空白對(duì)照，在波長(zhǎng)為510 nm 下測(cè)定各溶液吸光度，以蘆丁(總黃酮)質(zhì)量濃度(C，mg·mL-1)為橫坐標(biāo)，吸光度值(A)為縱坐標(biāo)，繪制蘆丁質(zhì)量濃度與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線為：A=11.983 C-0.040 9（R2=0.999 2，n=5），結(jié)果表明：在0.021 48 ～0.107 40 mg/mL 時(shí)，蘆丁質(zhì)量濃度與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

1.3.2 黃酮類化合物的測(cè)定方法

準(zhǔn)確移取1 mL 白木香葉提取液于10 mL 具塞試管中，操作步驟同上，以試劑空白作對(duì)照，最后于波長(zhǎng)510 nm 下比色，計(jì)算黃酮類化合物含量和得率。計(jì)算公式如下：

式中：C為計(jì)算的白木香葉總黃酮的濃度，mg·ml-1；V為提取溶液體積，mL；n為提取溶液稀釋倍數(shù)；m為所用白木香葉質(zhì)量，g。

1.4 白木香葉總黃酮類化合物提取工藝優(yōu)化試驗(yàn)

1.4.1 提取方法比較

分別采用醇浸漬提取法、醇溶劑回流提取法和超聲輔助提取法[9]對(duì)白木香葉黃酮類成分進(jìn)行提取，通過(guò)比較得率的大小選取合適的提取方法。

1.4.2 醇浸漬提取法

稱取白木香葉2 g，加入80 mL 60%乙醇，室溫下浸漬2 h，過(guò)濾，將濾液定容至80 mL，測(cè)定吸光度，計(jì)算黃酮類化合物得率。

1.4.3 醇溶劑回流提取法

稱取白木香葉2 g，加入80 mL 60%乙醇，水浴回流2 h，過(guò)濾，將濾液定容至80 mL，測(cè)定吸光度，計(jì)算黃酮類化合物得率。

1.4.4 超聲輔助醇提取法

稱取白木香葉2 g，加入80 mL 的60% 乙醇，超聲提取40 min，過(guò)濾，定容至80 mL，測(cè)定吸光度，計(jì)算黃酮類化合物得率。

1.5 單因素試驗(yàn)

分別選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間作為主要考察因素，探究對(duì)白木香葉黃酮類化學(xué)物提取的影響，確定各影響因素曲面響應(yīng)優(yōu)化范圍。

1.5.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮類化合物得率的影響

稱取白木香葉2 g，固定料液比(g·mL-1)為1:40，分別加入體積分?jǐn)?shù)為40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液，水浴回流提取2 h，趁熱過(guò)濾，將濾液定容至80 mL，測(cè)定吸光度，計(jì)算黃酮類化合物得率。

1.5.2 料液比對(duì)黃酮類化合物得率的影響

稱取白木香葉2 g，分別按照料液比（g·mL-1）為1:20、1:25、1:30、1:40、1:50 加入體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液，水浴回流提取2 h，趁熱過(guò)濾，將濾液分別定容至提取前體積，測(cè)定吸光度，計(jì)算黃酮類化合物得率。

1.5.3 提取時(shí)間對(duì)黃酮類化合物得率的影響

稱取白木香葉2 g，固定料液比(g·mL-1)為1:40，加入體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶液，分別水浴回流提取0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、3.0 h、4.0 h、5.0 h，趁熱過(guò)濾，將濾液定容至80 mL，測(cè)定吸光度，計(jì)算黃酮類化合物得率。

1.6 星點(diǎn)設(shè)計(jì)響應(yīng)面法（CCD）優(yōu)化提取工藝

選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間作為主要影響因素[10-11]，以白木香葉黃酮類化合物得率為響應(yīng)值，采用CCD 設(shè)計(jì)原理，通過(guò)三因素五水平設(shè)計(jì)，優(yōu)化白木香葉黃酮類化合物提取工藝，影響因素及水平設(shè)計(jì)如表1 所示。

表1 星點(diǎn)設(shè)計(jì)因素水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 提取方法比較結(jié)果

3 種提取方法對(duì)白木香葉黃酮類化合物的提取結(jié)果如表2 所示，在固定提取溶劑體積為60%和料液比為1:40 時(shí)，醇溶劑回流提取法對(duì)黃酮類化合物提取率為2.89%，提取效果最佳。因此，本研究采用此法繼續(xù)對(duì)單因素和星點(diǎn)設(shè)計(jì)響應(yīng)面法進(jìn)行提取工藝考察。

表2 不同提取方法提取白木香葉黃酮類成分結(jié)果表

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)得率的影響

圖1 為乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)得率的影響。由圖1 可以看出：當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)小于70%時(shí)，白木香黃酮類化合物得率隨其增加逐漸增大；在體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)，得率最大；當(dāng)體積分?jǐn)?shù)大于70%時(shí)，體積分?jǐn)?shù)增加，黃酮類化合物得率減小，這可能是由于乙醇體積分?jǐn)?shù)較高時(shí)，白木香葉中油脂和葉綠素等雜質(zhì)的溶解率增加，極性較大的黃酮類化合物溶出減少，得率下降。因此，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%～70%為后續(xù)優(yōu)化試驗(yàn)考察范圍。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)得率的影響

2.2.2 料液比對(duì)得率的影響

圖2 為料液比對(duì)得率的影響。由圖2 可知，在料液比為1:20 ～1:40 的范圍內(nèi)，料液比對(duì)白木香葉黃酮類化合物得率的影響是顯著的，料液比越大，得率越大；當(dāng)料液比為1:40 時(shí)，得率最大為2.35%；當(dāng)料液比繼續(xù)增加時(shí)，得率略微下降。這是由于在一定的料液比時(shí)，黃酮類化合物已基本完全溶解，因此，選擇料液比為1:25 ～1:40 為后續(xù)優(yōu)化試驗(yàn)考察范圍。

圖2 料液比對(duì)得率的影響

2.2.3 提取時(shí)間對(duì)白木香葉總黃酮得率的影響

圖3 為提取時(shí)間對(duì)得率的影響。由圖3 可知，提取時(shí)間對(duì)白木香葉黃酮類化合物的影響較為顯著，提取時(shí)間為0.5 ～2.0 h 時(shí)，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，得率呈上升趨勢(shì)，但得率僅增加0.13%，增速較為緩慢；提取時(shí)間為2 ～3 h 時(shí)，得率增加0.23%，提取時(shí)間的延長(zhǎng)能夠明顯提高得率；當(dāng)提取時(shí)間大于3 h 時(shí)，得率下降，這是由于加熱時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能會(huì)破壞黃酮類化合物某些熱敏性組分，因此提取時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，故選擇提取時(shí)間1.5 ～3.0 h 為后續(xù)優(yōu)化試驗(yàn)考察范圍。

圖3 提取時(shí)間對(duì)得率的影響

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝

2.3.1 模型擬合和統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

表3 為星點(diǎn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)及結(jié)果表。根據(jù)CCD 試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以白木香葉黃酮類化合物為響應(yīng)值，通過(guò)三因素五水平試驗(yàn)，設(shè)計(jì)優(yōu)化提取工藝，由軟件Design-Expert 12.0 對(duì)表3 中影響因素和響應(yīng)值進(jìn)行多項(xiàng)式模型擬合和回歸分析，得到如下方程：

表3 星點(diǎn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)及結(jié)果表

回歸模型方差分析結(jié)果如表4 所示，該模型決定系數(shù)R2為0.933 7，F(xiàn) 值為15.66，失擬項(xiàng)P ＞0.1 時(shí)不顯著，當(dāng)P ＜0.000 1 時(shí)極為顯著，說(shuō)明該二項(xiàng)式模型擬合程度較高，能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)實(shí)際情況。其中，單因素對(duì)響應(yīng)值影響程度較大，依次為B（料液比）＞C（提取時(shí)間）＞A（乙醇體積分?jǐn)?shù)），二次項(xiàng)中影響程度較大的為B2和C2，而交互項(xiàng)影響程度則較小。

表4 回歸模型方差分析結(jié)果表

2.3.2 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

回歸方程響應(yīng)面分析結(jié)果如圖4 所示，可通過(guò)分析3D 曲面圖的傾斜度確定交互項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值的影響程度，傾斜度越大，交互作用越強(qiáng)。由結(jié)果可知，除了AC 交互項(xiàng)之外，AB 和BC 交互項(xiàng)形成的曲面具有較大的傾斜度，對(duì)白木香葉黃酮類化合物得率具有較大的影響。通過(guò)軟件Degisn-Expert 12.0 對(duì)二項(xiàng)式回歸模型分析，得出白木香葉黃酮類化合物最佳提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，料液比1:40，提取時(shí)間2.992 h，為了方便操作，將提取時(shí)間修改為3 h，此工藝條件下，模型預(yù)測(cè)得率為3.14%。應(yīng)用此工藝條件提取黃酮類化合物穩(wěn)定性結(jié)果如表5 所示，得率的均值為3.10%，與模型預(yù)測(cè)值3.14%較為接近，說(shuō)明該二項(xiàng)式回歸模型以及該回歸方程具有可靠性，能較好地反映實(shí)際提取情況。

表5 工藝穩(wěn)定性結(jié)果表

圖4 各交互因素對(duì)白木香葉黃酮類化合物得率的影響圖

3 結(jié)語(yǔ)

本文以廣東揭陽(yáng)產(chǎn)的白木香葉為主要原料，以黃酮類化合物得率為指標(biāo)，綜合對(duì)比了幾種常見(jiàn)的黃酮類化合物提取方法，結(jié)果表明，醇溶劑回流提取法能有效提高得率。經(jīng)過(guò)單因素試驗(yàn)確定影響因素考察范圍，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)響應(yīng)面法，對(duì)其提取條件進(jìn)一步優(yōu)化后得到的最佳提取工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，料液比1:40，提取時(shí)間3 h，驗(yàn)證試驗(yàn)的結(jié)果表明本模型預(yù)測(cè)精度高，擬合效果良好，可為白木香葉資源的有效利用提供依據(jù)。