高效液相色譜多波長切換法同時測定更年寧中7種有效成分的含量

霍甜甜，李宜鮮，徐金玲，李彥超，申二永

作者單位：河南省藥品醫療器械檢驗院（河南省疫苗批簽中心），河南 鄭州450009

更年寧是由柴胡、黃芩、白芍、牡丹皮、女貞子（酒炙）等22味中藥組成，臨床主要用于緩解和治療更年期綜合征［1］。方中白芍、酒女貞子、丹皮、黃芩皆為制劑中的臣藥，白芍可養血斂陰、止汗、平抑肝陽；酒女貞子可滋肝益腎、有烏須、明目之功效；牡丹皮可清熱涼血、活血化瘀；黃芩可清熱燥濕兼瀉火解毒。上四味合用，既可以滋陰養血平抑肝陽，又可解方中補益藥之熱。上述四味臣藥中的七種活性成分及藥理作用主要為：白芍中的芍藥苷具有抗抑郁、消炎、鎮痛、保護肝臟、保護神經、鎮靜催眠、免疫調節等作用［2-3］；酒女貞子中的特女貞苷具有保肝利膽、降血糖血脂、免疫調節等作用［4-5］；牡丹皮中的丹皮酚可以消炎、同時具有保護神經、心血管、肝損傷等作用［6-8］；黃芩中的黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素具有保肝、利膽、抗腫瘤、抗菌消炎、抗抑郁、抗氧化［9-12］等作用。

更年寧現行標準——《中華人民共和國衛生部藥品標準》第六冊中，只規定了顯微鑒別和墨旱蓮的鑒別［13］，指標成分單一，且方中多味主藥的質量均未得到有效控制。多指標成分測定能更好的從整體上控制中成藥的內在質量［14-16］，本研究2021 年6 月至2022 年2 月完成，采用高效液相色譜-二極管陣列檢測器（HPLC-DAD）法同時更年寧中芍藥苷、特女貞苷、丹皮酚、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素7 種活性成分，從而可以更加全面地控制更年寧的內在質量。

1 材料與方法

1.1 儀器安捷倫1260 高效液相色譜儀，配備1260 二極管陣列檢測器（DAD）（美國安捷倫科技公司）；艾杰爾維納斯一代（Agela Venusil MP）C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱（天津博納艾杰爾科技有限公司）；XP105 電子天平（瑞士Mettler 公司）；水浴鍋XMTD-204（上海躍進醫療器械有限公司）；密理博超純水系統（德國密理博公司）。

1.2 試藥對照品芍藥苷（批號110736～201943，含量96.8%）、特女貞苷（批號111926～201906，含量95.0%）、黃芩苷（批號110715～201821，含量95.4%）、漢黃芩苷（批號112002～201501，含量98.8%）、丹皮酚（批號100708～200506，含量99.9%）、黃芩素（批號111595～201306，含量97.8%）、漢黃芩素（批號111514～201706，含量100.0%）均購自中國食品藥品檢定研究院；市售更年寧水蜜丸（吉林玉仁制藥股份有限公司，規格為4克∕袋，批號200201、200411；北京同仁堂，規格100粒∕10 克，批號18032338）；乙腈和甲醇均為色譜純（德國Merck公司）；水由密理博超純水系統制備。

1.3 方法

1.3.1色譜條件 色譜柱：Agela Venusil MP C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A），0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫程序［17］（0～5 min 15% A；＞5～25 min 15%～25% A；＞25～50 min 25%～60% A）；流速：1.0 mL∕min；檢測波長：0～14 min，232 nm（芍藥苷）；14～25 min，226 nm（特女貞苷）；25～50 min，276 nm（黃芩苷、漢黃芩苷、丹皮酚、黃芩素、漢黃芩素）；色譜柱溫：35 ℃；進樣量：10 μL。

1.3.2溶液制備

1.3.2.1對照品溶液 分別精密稱取芍藥苷、特女貞苷、黃芩苷、漢黃芩苷、丹皮酚、黃芩素、漢黃芩素對照品適量，加80%甲醇使溶解，配制成質量濃度依次為1 039.63、684.00、965.45、190.49、554.64、193.64、361.00 mg∕L 的單標溶液。分別取各單標溶液適量，置于同一容量瓶中，加80%甲醇溶解并稀釋至刻度，配制成各組分濃度依次為103.96、136.80、241.36、38.10、55.46、19.36、7.22 mg∕L 的混合對照品溶液1。分別精密移取2 mL、1 mL、0.5 mL、0.3 mL 的混合對照品溶液1，置于5 mL 量瓶中，用80%甲醇稀釋定容至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液2、3、4、5，備用。

1.3.2.2供試品溶液 取供試品適量，研細，稱取0.5 g（精確到0.001 g），置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，密塞搖散后稱定重量，加熱回流提取1 h，放至室溫后再稱定重量，用80%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，用0.45 μm 微孔濾膜濾過，即得［17］。

1.3.2.3陰性樣品溶液 按更年寧藥材配比和加工處理方法，分別制備缺白芍、酒女貞子、牡丹皮、黃芩和同時缺4 種藥材的陰性樣品溶液，按“1.3.2.2”項下方法制備各陰性樣品溶液，即得。

2 結果

2.1 方法學考察

2.1.1專屬性考察 取“1.3.2”項下混合對照品溶液3、供試品溶液及陰性樣品溶液，按“1.3.1”項下色譜條件進樣10 μL，記錄色譜圖（見圖1）。結果各成分色譜峰峰型對稱，分離度均大于1.5，理論塔板數均大于8 000。在混合對照品色譜峰相應的保留時間處，陰性樣品溶液沒有對應的色譜峰，說明其他成分對目標峰的測定無干擾，表明該方法專屬性良好［17］。

圖1 混合對照品、更年寧供試品及各陰性樣品色譜圖：A為混合對照品；B為更年寧樣品；C為缺白芍陰性樣品；D為缺酒女貞子陰性樣品；E為缺牡丹皮陰性樣品；F為缺黃芩陰性樣品；G為缺4種藥材陰性樣品

2.1.2線性關系考察 分別精密吸取“1.3.2.1”項下的混合對照品溶液1、2、3、4、5，按“1.3.1”項下色譜條件分別進樣，記錄各色譜峰峰面積，分別以各成分的濃度和峰面積為橫坐標和縱坐標（Y），繪制各成分標準曲線，計算回歸方程。結果表明，7 種成分在實驗范圍內線性關系良好。取混合對照溶液，用80%甲醇進行稀釋，以信噪比10∶1、3∶1分別計算定量限及檢出限，結果見表1。

表1 線性關系考察結果

2.1.3精密度試驗 取“1.3.2.1”項下混合對照品溶液3，按“1.3.1”項下記錄的色譜條件，連續進樣6次，記錄各成分色譜峰的峰面積，結果芍藥苷、特女貞苷、黃芩苷、漢黃芩苷、丹皮酚、黃芩素、漢黃芩素峰面積的相對標準偏差（RSD）分別為0.25%、0.72%、0.41%、0.88%、1.14%、1.01%、0.53%，表明儀器精密度良好。

2.1.4重復性試驗 取更年寧供試品（200201），按“1.3.2.2”項下方法平行制備6 份供試品溶液，按“1.3.1”項下記錄的色譜條件進樣測定，結果芍藥苷、特女貞苷、黃芩苷、漢黃芩苷、丹皮酚、黃芩素、漢黃芩素含量的平均值分別為1.443、1.959、2.171、0.621、0.767、0.222、0.090 mg∕g，RSD 分別為2.33%、1.74%、1.29%、0.93%、2.84%、2.05%、2.11%，表明該方法重復性良好。

2.1.5穩定性試驗 取更年寧供試品（200201），按“1.3.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“1.3.1”項下記錄的色譜條件分別在0、4、8、12、16、20、24 h 進樣測定，結果芍藥苷、特女貞苷、黃芩苷、漢黃芩苷、丹皮酚、黃芩素、漢黃芩素峰面積的RSD 分別為0.73%、0.98%、0.52%、1.04%、0.89%、1.14%、1.66%，結果表明在24 h內，該供試品溶液的穩定性良好。

2.1.6加樣回收率試驗 精密稱取更年寧供試品（200201）0.25 g 6 份，每組分別加入“1.3.2.1”項下的芍藥苷、特女貞苷、黃芩苷、漢黃芩苷、丹皮酚、黃芩素、漢黃芩素單標溶液0.35、0.7、0.5、0.8、0.35、0.3、0.07 mL，加入80%甲醇至25 mL，按“1.3.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“1.3.1”項下記錄的色譜條件進樣分析，計算各成分加樣回收率及RSD 值。結果見表2。結果表明，該方法準確度良好。

表2 加樣回收率試驗表（n=6）

2.2 樣品含量測定取4 個不同批次的更年寧樣品，按“1.3.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“1.3.1”項下記錄的色譜條件進行測定，結果見表3。

表3 樣品含量結果∕（mg∕g）

3 討論

柴胡疏肝解郁，為更年寧組方中的君藥，皂苷是柴胡中的主要生物活性成分［18］，《中國藥典》（2020 年版）采用HPLC 法測定柴胡中的柴胡皂苷a和柴胡皂苷d［19］，從而控制柴胡中的皂苷含量。在提取柴胡中皂苷時建議低溫、堿性環境下提?。?0］，但在該提取條件下，更年寧組方中其他活性成分提取率不高，因此本研究未將柴胡皂苷納入待測組分當中。在后期工作中，實驗室會進一步研究更年寧組方中柴胡的質量控制方法，以期更好的控制該制劑的質量。表3顯示，不同生產廠家，同一生產廠家的不同批次樣品之間，各成分含有量均存在一定差異，可能與原藥材產地、種植過程、采收季節、儲藏，飲片炮制差異及生產過程中各參數的控制等有關［21-23］。建議藥品生產企業進一步加強對飲片來源和制劑生產過程的質量控制，同時藥品監管部門進一步完善更年寧的質量控制標準，以確保更年寧制劑質量穩定，療效一致。

本研究采用HPLC-DAD 法同時測定更年寧中芍藥苷、特女貞苷、黃芩苷、漢黃芩苷、丹皮酚、黃芩素、漢黃芩素的含有量，該方法各被測化合物色譜峰峰型對稱，檢測準確、可靠、靈敏度高，獲得了滿意的分離和測定結果。本方法能夠有效的控制成藥組方中多種飲片的質量，從而達到保證藥效的目的，為更年寧的進一步質量研究提供了依據。