血清微RNA-429、腫瘤壞死因子受體相關因子6與肝癌肝動脈化療栓塞術靈敏度相關性及槐耳顆粒干預作用研究

崔明新，劉曉剛，程大銘，于敬坤，曲鳳智

作者單位：唐山市工人醫院肝膽外二科，河北 唐山063000

肝動脈化療栓塞術（TACE）是不能行根治手術肝癌病人的一種重要療法，但受肝硬化程度、肝功能狀態、腫瘤負荷等因素影響，并非所有病人均能達到理想效果，因此早期預測肝癌TACE 靈敏度，采取一定措施增加靈敏度較差病人治療反應性，對促進緩解意義重大［1］。微RNA-429（miR-429）與被證實肝癌、胃癌等多種腫瘤有關［2］。根據既往報道，miR-429能通過靶向鈣敏感受體∕信號轉導及轉錄活化因子3通路，增強卵巢癌、胰腺癌等腫瘤細胞增殖和化療耐藥性［3-4］。腫瘤壞死因子受體相關因子6（TRAF6）是TOLL 樣受體4下游物質，在肝癌細胞體外實驗中，沉默TRAF6 可拮抗核因子κB 信號傳導，減輕化療抗性［5］。可見miR-429、TRAF6均與化療靈敏度有關。槐耳顆粒是肝癌等腫瘤不宜手術者與化療者輔助用藥，具有扶正固本，活血消癥作用，應用于乳腺癌病人，可降低其化療耐藥［6］。基于以上背景，本研究嘗試探討血清miR-429、TRAF6 與肝癌TACE 靈敏度相關性及槐耳顆粒干預作用，旨在為臨床早期預測肝癌TACE 靈敏度、治療肝癌及深入認識其不同治療反應性機制等提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2016 年1 月至2021 年1 月唐山市工人醫院收治的80 例肝癌病人作為研究對象進行前瞻性研究。納入標準：①符合肝癌診斷標準［7］，臨床分期難以手術治療或因身體原因不能、不愿手術治療者；②年齡范圍18～80歲；③入組前未接受過外科手術或化療、免疫治療、靶向治療等相關抗癌治療；④巴塞羅那分期（BCLC）分期為A 期、B期或C期，但門脈主干癌栓的BCLC分期C期病人不入選；⑤Child-Pugh 分級為A 級或B 級；⑥美國東部腫瘤協作組（ECOG）體力狀態評分≤2 分；⑦預計生存期≥12 周；⑧中醫辨證為正氣虛弱、瘀血阻滯型，癥見神疲乏力、少氣懶言、脘腹疼痛或脹悶、納谷少馨、大便干結或溏泄，脈澀，舌質紫暗或有瘀斑。排除標準：①心、腎功能嚴重不全者；②伴血液系統疾病者；③有相關藥物過敏史者；④過敏體質者；⑤無法進行正常溝通交流者。剔除標準：①符合納入標準，入選后退出的；②受試者依從性差，未按規定診療進行者。

采用電腦隨機數字表法，按照隨機、平行、對照原則分為對照組和觀察組，各40例。其中觀察組女18 例，男22 例；年齡范圍35～76 歲，年齡（54.25±9.57）歲；體質量指數范圍19～26 kg∕m2，體質量指數（23.76±1.05）kg∕m2；BCLC 分期A 期5 例，B 期14 例，C 期21 例；Child-Pugh 分級為A 級17 例，B 級23 例；ECOG 評分0 分8 例，1 分21 例，2 分11 例；對照組女21 例，男19 例；年齡范圍34～75 歲，年齡（52.98±9.33）歲；體質量指數范圍19～26 kg∕m2，體質量指數（23.90±0.97）kg∕m2；BCLC 分期A 期7 例，B 期15 例，C 期18 例；Child-Pugh 分級為A 級20 例，B 級20 例；ECOG評分0分10例，1分24例，2分6例。兩組性別（χ2=0.45，P=0.502）、年齡（t=0.60，P=0.550）、體質量指 數（t=0.62，P=0.537）、BCLC 分 期（χ2=0.60，P=0.741）、Child-Pugh 分級（χ2=0.45，P=0.501）、ECOG評分（χ2=1.89，P=0.388）均衡可比。本研究獲唐山市工人醫院倫理委員會審核通過［批號2016-（019）］，病人充分知曉，自愿簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1治療方法 兩組均給予TACE 治療。對照組術后1 d 起口服甲苯磺酸索拉非尼片（石藥集團歐意藥業有限公司，批號H20213311，批次20151026），每次0.4 g，2 次∕日，空腹吞服。觀察組在對照組基礎上，于術前1個月及術后3 d開始口服槐耳顆粒（啟東蓋天力藥業有限公司，批號Z20000109，批次20160104），每次20 g，3 次∕日。術后3個月評估療效。

1.2.2療效與治療靈敏度評估 參考改良實體瘤療效評價標準1.1［8］，將療效分為完全緩解（所有靶病灶消失）、部分緩解（以基線直徑總和為參照，靶病灶直徑總和降低≥30%）、穩定（以研究中直徑總和最小值為參照，縮小程度與部分緩解不符合，增大程度不符合疾病進展）、進展（以研究中直徑總和的最小值為參照，靶病變直徑總和增加≥20%，直徑總和絕對增長≥5 mm 或出現≥1 處新病灶），在治療前后分別行CT 掃描，按照以上標準對療效進行評價，總有效率取完全緩解、部分緩解、穩定之和；治療靈敏度評估：完全緩解=敏感，部分緩解=一般，穩定和進展=較差。

1.2.3血清miR-429、TRAF6蛋白檢測 于治療前、術后1 個月、術后3 個月，分別采集空腹外周靜脈血5 mL，12 000g離心10 min，分離血清，采用實時熒光聚合酶鏈反應法檢測血清miR-429 水平；采用蛋白質印跡法檢測TRAF6蛋白表達。

1.3 觀察指標（1）比較兩組總有效率。（2）比較兩組血清miR-429、TRAF6 蛋白。（3）治療前后血清miR-429、TRAF6 蛋白變化與靈敏度關系。（4）不同靈敏度病人治療前后血清miR-429、TRAF6 蛋白變化比較。（5）血清miR-429、TRAF6蛋白術后1個月與治療前差值預測敏感的價值。（6）分析治療前血清miR-429與TRAF6蛋白關系。

1.4 統計學方法數據采用SPSS 24.0 分析，計數資料用例（%）表示，χ2檢驗；計量資料采取Bartlett方差齊性檢驗與Kolmogorov-Smirnov 正態性檢驗，均確認具備方差齊性且近似服從正態布，以表示，多組間比較以單因素方差分析，兩兩比較以LSD-t檢驗，組間比較行獨立樣本t檢驗，組內比較行配對t檢驗；不同時間點、組別交互作用下血清miR-429、TRAF6 蛋白，采用重復測量資料的方差分析；應用Spearman 分析治療前后血清miR-429、TRAF6 蛋白變化與靈敏度關系，采用受試者操作特征（ROC）曲線及曲線下面積（AUC）分析血清miR-429、TRAF6 蛋白治療前后變化預測治療敏感的價值，Pearson 分析血清miR-429 與TRAF6 蛋白關系。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組療效比較觀察組總有效率為95.00%，高于對照組80.00%（P＜0.05）。見表1。

表1 肝癌80例療效比較∕例（%）

2.2 兩組血清miR-429、TRAF6 蛋白比較術后1個月、術后3 個月兩組血清miR-429 較治療前升高，TRAF6 蛋白較治療前降低（P＜0.05）；且觀察組血清miR-429 高于對照組，TRAF6 蛋白低于對照組（P＜0.05）。見表2。

表2 肝癌80例血清miR-429、TRAF6蛋白比較∕

表2 肝癌80例血清miR-429、TRAF6蛋白比較∕

注：miR-429為微RNA-429，TRAF6為腫瘤壞死因子受體相關因子6，β-actin為β肌動蛋白。

2.3 治療前后血清miR-429、TRAF6蛋白變化與靈敏度關系觀察組血清miR-429、TRAF6 蛋白術后1 個月與治療前差值、術后3 個月與治療前差值大于對照組（P＜0.05），見表3；分析血清miR-429、TRAF6 蛋白變化與靈敏度關系，結果顯示，血清miR-429（r=0.78、0.76，均P＜0.001）、TRAF6 蛋白（r=0.74、0.72，均P＜0.001）術后1個月與治療前差值、術后3 個月與治療前差值與靈敏度呈正相關，見圖1（完全緩解=3，部分緩解=2，穩定和進展=1）。

圖1 肝癌80例血清微RNA-429（miR-429）腫瘤壞死因子受體相關因子6（TRAF6）蛋白術后與術前差值變化與靈敏度關系：A為血清miR-429術后1個月；B為血清miR-429術后3個月；C為TRAF6蛋白術后1個月；D為TRAF6蛋白術后3個月

表3 肝癌80例治療前后血清miR-429、TRAF6蛋白變化比較∕

表3 肝癌80例治療前后血清miR-429、TRAF6蛋白變化比較∕

注：miR-429為微RNA-429，TRAF6為腫瘤壞死因子受體相關因子6，β-actin為β肌動蛋白，差值均指絕對值。

2.4 不同靈敏度病人治療前后血清miR-429、TRAF6 蛋白變化比較血清miR-429、TRAF6 蛋白術后1 個月與治療前差值、術后3 個月與治療前差值：敏感＞一般＞較差，兩兩比較均差異有統計學意義（P＜0.05）。見表4。

表4 肝癌80例不同靈敏度病人血清miR-429、TRAF6蛋白變化比較∕

表4 肝癌80例不同靈敏度病人血清miR-429、TRAF6蛋白變化比較∕

注：miR-429為微RNA-429，TRAF6為腫瘤壞死因子受體相關因子6，β-actin為β肌動蛋白。①與敏感比較，P＜0.05。②與一般比較，P＜0.05

2.5 血清miR-429、TRAF6 蛋白術后1 個月與治療前差值預測敏感的ROC以敏感者血清miR-429、TRAF6 蛋白術后1 個月與治療前差值作為陽性樣本，以一般+較差者血清miR-429、TRAF6 蛋白術后1 個月與治療前差值作為陰性樣本，繪制ROC 顯示，血清miR-429 術后1 個月與治療前差值預測敏感 的AUC 及 其95%CI為0.78（0.51，1.00）（P=0.023），TRAF6蛋白術后1個月與治療前差值預測敏感的AUC及其95%CI為0.74（0.50，0.98）（P=0.044），見圖2。

圖2 肝癌80例血清微RNA-429（miR-429）、腫瘤壞死因子受體相關因子6（TRAF6）蛋白術后1個月與治療前差值預測敏感的ROC曲線：2A為血清miR-429；2B為TRAF6蛋白圖3 肝癌80例血清微RNA-429（miR-429）與腫瘤壞死因子受體相關因子6（TRAF6）蛋白關系

2.6 治療前血清miR-429 與TRAF6 蛋白關系治療前血清miR-429 與TRAF6 蛋白呈負相關（r=-0.70，P＜0.001），見圖3。

3 討論

近年來肝癌中西醫結合微創診療模式被提出，其立足于中醫辨證施治療的整體治療優勢和腫瘤微創介入局部治療特點，使BCLC A 期達到與開放性手術相同的根治性效果，使以往開放性手術不能治療的BCLC B∕C期肝癌亦獲得滿意效果，將肝癌治療帶入人文診療新模式［9］。但中醫藥種類繁多，選取何種藥物能獲得預期效果值得探討。

中醫學認為，正氣虛弱，邪氣乘襲，蘊結于肝，氣滯血瘀，形成痞塊，乃至肝癌，因此宜治以扶正固本，活血消癥。本研究對肝癌病人應用具有扶正固本，活血消癥功效的槐耳顆粒，結果顯示，觀察組總有效率高于對照組，提示槐耳顆粒能增強肝癌TACE 療效，增加病人獲益。王海瑞、劉兆玉［10］研究發現，在TACE 基礎上聯合槐耳顆粒，可提高TACE療效，延長中位腫瘤進展時間，本研究觀點與之一致。槐耳顆粒富含生物堿、蛋白質、多糖蛋白等成分，可抑制腫瘤活性，提高免疫力，抑制肝炎病毒，并能改善肝區疼痛、腹脹、乏力等癥狀，可見槐耳顆粒不僅對肝癌細胞具有直接抑制作用，還能通過抑制肝炎病毒復制、增強體質等途徑，間接發揮抗腫瘤功效。中醫扶正祛邪提升機體免疫功能，重塑不宜癌細胞生長的微環境，抑制影像學不可見的微小腫瘤，將中醫藥微環境調理與肝癌TACE 相結合作為特色，充分發揮TACE 局部治療與中醫藥整體治療優勢，所以能增加治療靈敏度，提高療效。

miR-429 是微小RNA 家族成員之一，敲低miR-429 可抑制肝癌細胞的侵襲性，使用模擬物上調miR-429表達可加重肝癌進展，提示miR-429與肝癌惡性生物學行為有關，呈現出促癌因子作用［11-12］。本研究顯示，血清miR-429 術后1 個月與治療前差值、術后3個月與治療前差值與靈敏度呈正相關，治療后升高幅度越大者，治療靈敏度越高，有助于預測病人治療靈敏度。且兩組術后1個月、術后3個月血清miR-429較治療前升高，且觀察組血清miR-429高于對照組，提示槐耳顆粒能提高miR-429表達，有助于改善肝癌TACE 靈敏度。結合資料［13］分析，miR-429 過表達能通過靶向雙特異性磷酸酶4 抑制JNK信號通路來提高癌細胞對化療的靈敏度。也有觀點［14］認為，miR-429 過表達是通過抑制腫瘤細胞增殖、遷移發揮抑癌作用，從而提高治療反應性的。

TRAF6 可調控免疫反應、細胞增殖、凋亡等［15］。本研究顯示，不同治療靈敏度病人TRAF6 蛋白表達不同，治療后降低幅度越大者，治療靈敏度越高，提示TRAF6蛋白與肝癌TACE靈敏度有關。且兩組術后1 個月、術后3 個月TRAF6 蛋白較治療前降低，觀察組低于對照組，提示槐耳顆粒可降低TRAF6 蛋白水平，有助于增加病人治療靈敏度。謝正元等［16］研究發現，槐耳顆粒能抑制肝癌細胞增殖，促進肝癌細胞凋亡，減少并逆轉肝癌細胞對阿霉素的耐藥性，提高治療靈敏度，本研究觀點與之相似。治療前較高的TRAF6 可通過細胞外信號調節激酶通路，抑制肝癌細胞凋亡，增加TACE 治療的抗性，降低病人治療靈敏度，治療后TRAF6 下調則能促進肝癌細胞凋亡，并能阻止核因子-κB 信號通路傳導，抑制肝癌細胞轉移，從而改善治療靈敏度［17-18］。

同時本研究還發現，血清miR-429、TRAF6 蛋白術后1 個月與治療前差值預測敏感的AUC 分別為0.78、0.74，提示兩者可作為早期預測肝癌TACE 靈敏度的標志物，為臨床精準干預提供客觀參考依據。此外治療前血清miR-429與TRAF6蛋白呈負相關，表明血清miR-429與TRAF6蛋白有關，呈現出負向調節作用。Wang 等［19］報道，上調miR-429 通過核因子-κB 通路靶向TRAF6 來抑制肝癌細胞的遷移，佐證了miR-429 與TRAF6 具有上下游靶向作用關系。可見miR-429∕TRAF6 或可成為改善肝癌TACE靈敏度的一個靶點。

綜上所述，血清miR-429、TRAF6 與肝癌TACE靈敏度相關，槐耳顆粒可提高miR-429 表達，降低TRAF6蛋白，增強肝癌TACE靈敏度，提高療效。