Y染色體性別決定區相關高速泳動族框因子9和周期素依賴性激酶4在結直腸息肉、結直腸癌中的表達及意義

趙玉紅，張磊，古彩喆，張東姣，楊衛振

作者單位：1中國人民解放軍第八十二集團軍醫院消化內科，河北 保定 071000；2保定市第一中心醫院普外二科，河北 保定071000

結直腸癌其發病率和病死率在消化系統惡性腫瘤中一直居高不下，嚴重危害病人健康［1］。大量研究發現，結直腸癌的發生、發展受多種基因、多個因子共同調節［2-4］，探討結直腸癌生物標志物表達水平與病人臨床病理參數之間的關系，有助于盡早診斷結直腸癌，并采取針對性治療措施，改善預后。Y染色體性別決定區相關高速泳動族框因子9（SOX9）是一種與人體早期胚胎發育有關的重要轉錄因子，越來越多的研究發現其異常表達與人類多種腫瘤如胃癌［5-6］、口腔鱗癌［7］等的發生發展及預后有關。通常認為，腫瘤的發生與癌基因的激活、抑癌因子抑制或失活有關，其最終均體現在細胞周期異常上。周期素依賴性激酶4（CDK4）是細胞周期調控機制的重要相關蛋白，被認為是治療惡性腫瘤的一個重要靶點，且具有一定特異性［8-9］。研究發現，CDK4 的激活依賴于細胞周期蛋白（cyclins），當細胞異常活化時，細胞周期失控，癌細胞出現失控性增長［10］。還有研究發現，SOX9 可通過影響CDK4的表達參與肺腺癌的發展過程［11］。但關于SOX9、CDK4 表達與結直腸癌的關系研究報道甚少，因此，本研究檢測SOX9、CDK4 在結直腸癌的表達情況，分析二者表達情況及與臨床病理的關系，討論其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取中國人民解放軍第八十二集團軍醫院2015 年1 月至2017 年6 月收治的結直腸癌病人病理組織標本（結直腸癌組）94 例及癌旁正常結直腸組織（正常結直腸組）39 例，另取同時期結直腸息肉病人結直腸息肉組織（結直腸息肉組）51例，所有組織標本均用4%中性甲醛固定，常規脫水，采用石蠟包埋。納入標準：①均接受根治術治療；②結直腸癌病人術前均未接受放、化療；③臨床資料完整。排除標準：①合并其他惡性腫瘤；②合并急、慢性感染性疾病；③合并免疫系統疾病病人。94例結直腸癌中，男61例，女33例；年齡范圍39～80歲，中位年齡64 歲，＜60 歲41 例，≥60 歲53 例；結腸癌46例，直腸癌48例；低分化癌32例，中、高分化癌62 例；腫瘤分期Ⅰ+Ⅱ期39 例，Ⅲ+Ⅳ期55 例；合并淋巴結轉移52 例，無淋巴結轉移42 例。結直腸息肉病人中，男32 例，女19 例；年齡范圍40～78 歲，中位年齡62歲。結直腸癌和結直腸息肉病人的性別、年齡比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。病人或其近親屬知情同意并簽署知情同意書，本研究經中國人民解放軍第八十二集團軍醫院醫學倫理委員會審核通過（批號14001251）。

1.2 主要試劑和方法兔抗人多克隆抗體SOX9（美國R&D 公司），一抗工作濃度為1∶200；兔抗人抗體CDK4（北京百奧萊博科技有限公司），稀釋濃度1∶100。將組織以4 μm 切片，充分烘烤后采用免疫組織化學SP染色法檢測結直腸癌組織、結直腸息肉組織和正常結直腸組織SOX9、CDK4 的表達。免疫組化Envision 染色法按照試劑盒說明書步驟進行。利用磷酸緩沖鹽溶液代替一抗作為陰性對照。

1.3 結果判定SOX9 陽性表達主要定位于細胞核，CDK4 陽性表達主要定位于細胞核和細胞質，以細胞染色強度和陽性表達百分比得分乘積進行判定。隨機選取5個高倍鏡視野進行評分：（1）按細胞染色強度評分：細胞不著色為0 分，淡黃色為1 分，黃色或黃棕色為2 分，棕褐色為3 分；（2）按陽性細胞所占百分比評分：陽性細胞＜5%為0分，陽性細胞≥5%～25%為1分，陽性細胞≥25%～50%為2分，陽性細胞≥50%為3分。兩項評分的乘積即為最終得分，若得分≥3 則認為表達陽性（+），否則判斷為陰性（-）。同時將得分≥4 分定義為高表達，＜4 分定義為低表達。

1.4 蛋白質印跡法分析加入苯甲基磺酰氟（PMSF）：放射免疫沉淀法裂解液（天津為科生物技術有限公司，稀釋濃度1∶250）裂解組織，從組織中提取蛋白質。在離心機中離心（12 000g，4 ℃）10 min 后，通過12%的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離上清液，并轉移至PVDF 膜上，轉膜結束后封閉、洗膜，隨后加入兔抗人SOX9、CDK4、β 肌動蛋白（β-actin）抗體（稀釋濃度1∶800）4 ℃孵育過夜，再次洗膜后加入二抗（稀釋濃度1∶5 000）室溫孵育1 h，洗滌后曝光、顯色。使用Quantity One 軟件評估SOX9、CDK4 蛋白的表達水平。

1.5 隨訪復查對于臨床病理診斷早期病人在術后3、6、12個月進行定期復查隨訪，之后每年進行一次；中晚期病人術后每3個月進行一次復查隨訪，完成3 年隨訪后可每6 個月一次。本研究隨訪時間從確診之日起，到2020年7月1日止，中位隨訪時間為23 個月。比較不同SOX9、CDK4 表達情況結直腸癌病人生存情況。

1.6 統計學方法利用SPSS 22.0 統計學軟件進行數據錄入與分析，計量資料用表示，三組間比較行單因素方差分析，有差異時采用SNK-q檢驗；計數資料用例（%）表示，行χ2檢驗。結直腸癌組織中SOX9、CDK4 表達相關性用Pearson 法；生存分析用Kaplan-Meier 法，組間生存曲線差別用對數秩檢驗（log-rank test）。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SOX9、CDK4 免疫組化染色結果SOX9、CDK4 在正常結直腸組織、結直腸息肉組織和結直腸癌組織中的陽性表達率分別為10.26%（4∕39）、27.45%（14∕51）、76.59%（72∕94），差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 SOX9、CDK4在正常結直腸組織、結直腸息肉組織和結直腸癌組織中的表達情況∕例（%）

2.2 SOX9、CDK4 蛋白表達水平比較正常結直腸組織中SOX9、CDK4 蛋白表達水平低于結直腸息肉組織、結直腸癌組織（P＜0.05），結直腸息肉組織中SOX9、CDK4 蛋白表達水平低于結直腸癌組織（P＜0.05）。見表2。

表2 SOX9、CDK4蛋白在正常結直腸組織、結直腸息肉組織和結直腸癌組織中的表達情況∕例（%）

2.3 SOX9、CDK4 表達與結直腸癌病人臨床病理參數之間的關系結直腸癌病人病理組織SOX9、CDK4 表達與病人年齡、性別、腫瘤類型差異無統計學意義（P＞0.05），與腫瘤分化程度、臨床分期、是否合并淋巴結轉移有關（P＜0.05），見表3。

表3 SOX9、CDK4表達與結直腸癌病人臨床病理參數之間的關系∕例

2.4 結直腸癌組織中SOX9、CDK4 表達相關性結直腸癌組織中SOX9 與CDK4 表達呈正相關（r=0.58，P＜0.001），見圖1。由TCGA 數據庫檢索結直腸癌組織SOX9、CDK4 基因表達相關性顯示，二者之間亦呈正相關（r=0.40，P＜0.001），見圖2。

圖1 結直腸癌組織中SOX9（Y染色體性別決定區相關高速泳動族框因子9）、CDK4（周期素依賴性激酶4）表達相關性

圖2 TCGA數據庫中結直腸癌組織SOX9（Y染色體性別決定區相關高速泳動族框因子9）、CDK4（周期素依賴性激酶4）基因表達相關性

2.5 SOX9、CDK4 不同表達情況的結直腸癌病人生存分析94 例結直腸癌生存50 例，死亡44 例。繪制術后1～36 個月SOX9、CDK4 高表達、低表達病人的生存曲線。SOX9 高表達病人術后3 年累積生存率為44.6%，低表達病人術后3 年累積生存率為72.4%，兩組比較Log-rank 檢驗，差異有統計學意義（χ2=8.31，P=0.004）。CDK4 高表達病人術后3 年累積生存率為25.6%，低表達病人術后3 年累積生存率為76.5%，兩組比較Log-rank 檢驗，差異有統計學意義（χ2=36.36，P＜0.001）。

3 討論

近年來，中國居民結直腸癌的發病率呈逐年上升趨勢，每年新發病例近37.6 萬人，大城市增加尤為明顯［12］。臨床研究發現，結直腸癌在初診時約20%～25%已發展為伴有轉移的晚期結直腸癌，嚴重威脅病人生命［13］。早期診斷、及時手術是改善結直腸癌病人生存率的重要途徑。尋找早期預測結直腸癌發生發展的生物學指標是目前研究的熱點。多項研究報道稱［14-15］，SOX9 在多種癌癥中均有差異性表達，被稱為癌基因，并且其在癌組織中表達上調提示預后不良［16］。本研究結果顯示，在結腸癌組織、結腸息肉組織和正常結腸組織中，SOX9 表達依次降低，表明高表達SOX9 與癌癥發生有關。臨床病理參數結果顯示，腫瘤分化程度低、臨床分期Ⅲ+Ⅳ、合并淋巴結轉移的結直腸癌病人腫瘤組織中SOX9 高表達比例較高，提示SOX9 可能參與結直腸癌分化、轉移進程。生存分析結果顯示，SOX9 高表達病人3年累積生存率明顯低于低表達，提示SOX9高表達病人預后差，與其他學者發現一致［17］。最近有研究發現，長鏈非編碼RNA（LncRNA）肺腺癌轉移相關轉錄因子（MALAT1）可通過下調miRNA-145（miR-145）和上調SOX9 來促進結直腸癌細胞增殖、侵襲和轉移，揭示了LncRNA MALAT1∕miR-145∕SOX9 軸在結直腸癌中的調控作用［18］。另有報道稱，癌基因SOX9 通過直接與叉頭盒轉錄因子K2（FOXK2）啟動子結合調控FOXK2 上調，而FOXK2在結直腸癌組織中轉錄激活，其高表達與生存率低顯著相關［19］。因此，推測SOX9 可能通過參與或激活某種通路基因表達來參與結直腸癌的發生發展進程，并與病人預后不良有關。

大量研究發現，細胞周期進程受一系列細胞周期蛋白依賴性激酶（CDKs）及其激活因子Cyclins 的調控［20］。CDK4 作為CDKs 家族中的一員，通過與CyclinD1 結合形成CyclinD1-CDK4 復合物，參與抑制Rb蛋白磷酸化進程，在細胞周期進展過程中起重要調控作用［21-22］。本研究結果顯示，CDK4在結直腸癌組織、結直腸息肉組織及結直腸正常組織中表達逐漸降低，其表達水平與結直腸癌病人腫瘤分化程度、臨床分期、是否合并淋巴結轉移有關，提示CDK4 可能參與結直腸癌細胞分化、侵襲過程，且高表達與病人預后差有關。國外學者Rahman 等［23］從基因綜合表達的兩個微陣列數據集中篩選診斷結直腸癌的分子生物標志物及藥物靶向定位，其中CDK4 是10 個中樞蛋白之一，同時也是9 個有針對性的藥物靶標之一。另有研究發現［24］，CDK4 是miR-142-3p 的潛在靶點，細胞實驗證實miR-142-3p模擬物和抑制物可分別降低和升高結直腸癌細胞中的CDK4蛋白表達，表明miR-142-3p可靶向CDK4抑制結直腸癌腫瘤細胞的增殖。報道稱，p16-CDK4∕6-Rb-E2F 通路失調是癌癥發生的標志，CDK4和CDK6 是該通路中的致癌激酶，被證實為抗癌靶點，任何原因導致其異常高表達時，均會引起細胞周期失控，導致腫瘤的發生及惡化［25］。根據上述觀點總結認為，CDK4 可能通過參與激活腫瘤通路或者受miRNA 靶向作用調控結直腸癌的發生、進展。研究顯示，SOX9 和CDK4 在肺腺癌腫瘤組織中均升高，SOX9 可通過正調節CDK4 在腫瘤細胞生長中發揮協同作用［11］。本研究相關性分析發現，結直腸癌組織中SOX9 與CDK4 表達呈正相關，且經TCGA 數據庫檢索結果發現，結直腸癌組織中SOX9、CDK4基因表達亦呈正相關，提示二者可能通過不同途徑作用參與腫瘤的病理進程，具體作用方式及機制有待進一步研究。

綜上所述，SOX9、CDK4在結直腸癌組織中均呈高表達，二者表達水平與腫瘤分化程度、臨床分期、淋巴結轉移情況及病人預后有關，表明SOX9、CDK4參與結直腸癌的發生發展過程，可能成為臨床評價結直腸癌病情及預后的潛在生物指標。結直腸癌的發生受多種因子、多個通路共同影響，后續還需通過細胞或動物等基礎實驗進一步探討其具體作用機制。