CUL4相關因子7、微RNA-589-5p在結直腸癌組織中表達與臨床病理特征及預后的關系

楊洋，王高波，李文清，王佳，楊博偉，馬蓉

作者單位：寶雞市人民醫院結直腸肛門外科，陜西 寶雞721000

據全球數據統計，2020 年結直腸癌的全球發病率位居第3 位，死亡率位居第2 位［1-2］。結直腸癌也是我國的第三大常見惡性腫瘤［3］。尋找有效的分子靶標對改善結直腸癌病人預后有重要作用。相關研究顯示，微RNA 與結直腸癌的發生、發展及預后存在密切關系［4-6］。微RNA-589-5p（miR-589-5p）可調控細胞的增殖、凋亡［7］。He 等［8］研究顯示，miR-589-5p 低表達促進喉癌細胞的增殖遷移。Qian 等［9］通過分析顯示，CUL4 相關因子7（DCAF7）對轉移性腎細胞癌具有診斷價值，且對腎細胞癌病人預后具有良好的預測價值。筆者通過檢索Target Scan Human 網站發現，miR-589-5p 與DCAF7 存在結合位點。本研究選取結直腸癌病人78例為研究對象，探究miR-589-5p、DCAF7在結直腸癌中臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料納入2018 年9 月至2019 年9 月于寶雞市人民醫院行結直腸癌根治術的78例病人，年齡范圍32～73 歲，年齡（53.29±11.61）歲，男性46 例，女性32 例。手術過程中留取癌旁組織及結直腸癌組織，癌旁組織距離腫瘤組織上緣＞5 cm，組織沖洗后，液氮冷凍。TNM 分期參照第7 版（2010）結直腸癌美國癌癥聯合委員會（AJCC）分期標準［10］。納入標準：①術后標本經病理診斷為結直腸癌；②原發性結直腸初診者；③年齡大于20 歲。排除標準：①合并其他惡性腫瘤；②術前接受過腫瘤放、化療；③合并心、肝、腎等嚴重疾病者；④存在自身免疫缺陷疾病。病人或其近親屬知情同意，本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2 檢測結直腸癌組織中miR-589-5p、DCAF7 mRNA 表達水平使用TRIzol 試劑（北京百奧萊博科技有限公司）提取組織總RNA，用NanoDropND-1000 分光光度儀（美國NanoDrop Tech 司）檢測RNA的純度及濃度，依據Primescript RT Reagent Kit（日本TaKaRa公司）說明書反轉錄得到互補DNA（cDNA）。采用7300 型實時熒光定量PCR 儀（美國ABI 公司）對miR-589-5p、DCAF7 mRNA及內參U6、β肌動蛋白（β-actin）進行擴增反應。按照試劑盒說明書建立反應體系，每個樣品設3個復孔。miR-589-5p、U6引物由上海生工合成。反應條件：95 ℃，3 min；95 ℃，30 s；61 ℃，30 s；72 ℃，30 s；40 個循環。反應結束后收集數據，并對所得數據Ct 值進行分析，用2-ΔΔCt法計算miR-589-5p相對表達量。引物設計見表1。

表1 實時熒光定量PCR法引物序列

1.3 免疫組化檢測結直腸癌組織中DCAF7蛋白表達采用免疫組化染色法檢測DCAF7 蛋白表達。陰性對照采用生理鹽水磷酸鹽緩沖液（PBS）。結果判定：由2位專業人員盲法審片，每個實驗結果選取5個高倍鏡視野進行計數。DCAF7陽性表達為出現棕黃色至棕褐色顆粒。按染色強度計分：無著色（0分），淺黃色（1分），棕黃色（2分），棕褐色（3分）。陽性細胞所占百分比評分：≤10%記0 分，11%～50%計1 分，51%～75%計2 分，＞75%計3 分。兩次評分乘積為最終得分，≤2分為陰性表達，＞2分為陽性表達。

1.4 隨訪從結直腸癌病人入院手術后開始隨訪，隨訪至2021年9月，最長隨訪時間3年，以電話或門診方式隨訪。記錄病人總生存時間，即開始治療到至因任何原因引起死亡的時間。

1.5 Ualcan 數據庫檢索在Ualcan 數據庫（http：∕∕ualcan.path.uab.edu）中檢索。設定gene symbol 分別為miR-589-5p、DCAF7，設定用TCGA 數據庫為Colon adenocarcinoma，分析miR-589-5p、DCAF7表達。

1.6 細胞實驗

1.6.1細胞培養 將結直腸癌細胞（SW837）及人結腸上皮細胞NCM460接種于含有1%雙抗+10%胎牛血清（FBS）的DMEM 培養基中，常規培養。待細胞融合度到70%～80%時，傳代2～3次。

1.6.2分組及轉染 將SW837 細胞接種到6 孔板（2×105個∕孔）中在培養箱培養24 h 后，細胞分為Control 組、mimic 組、miR mimic 組，miR mimic+pc-NC 組，miR mimic+pc-DCAF7 組，使用Lipofectamine?2000 試劑盒分別將mimic、miR-589-5p mimic、pcDNA3.1、pcDNA3.1 DCAF7 轉染至各組SW837 細胞，48 h 后，收取轉染細胞，實時熒光定量PCR 法檢測miR-589-5p、DCAF7表達。

1.6.3Transwell 實驗檢測SW837 細胞侵襲能力取“1.6.2”方法中的各組SW837 細胞，Transwell 小室上室中Matrigel 膠晾干后，吸取200 μL 細胞懸液注入Transwell 小室上室內，下室添加500 μL 培養基，培養箱常規培養48 h，擦去未過膜的SW837 細胞，無水乙醇固定（15 min）后進行結晶紫染色（25 min），在鏡下隨機選擇5個視野，計算侵襲細胞數。

1.6.4雙螢光素酶報告基因檢測miR-589-5p、DCAF7 的靶向關系 使用TargetScanHuman 網站預測miR-589-5p 與DCAF7 的結合位點；擴增與miR-589-5p結合的DCAF7 3’UTR 片段，與pmirGLO 載體連接構建pmirGLO-DCAF7-wt 野生型載體；使用定點突變技術將結合片段突變，構建pmirGLODCAF7-mut 突變型載體。將SW837 細胞分為pmir-GLO-DCAF7-wt+miR-589-5p mimic 組、pmirGLODCAF7-wt+mimic NC 組、pmirGLO-DCAF7-mut+miR-589-5p mimic 組、pmirGLO-DCAF7-mut+mimic NC組，將pmirGLO-DCAF7-wt、pmirG LO-DCAF7-mut、mimic NC、miR-589-5p mimic 分別轉染至SW837 細胞中，24 h后檢測海腎及螢火蟲螢光值，計算相對螢光素酶活性。

1.7 統計學方法采用軟件SPSS 25.0 對數據進行分析，計量資料（miR-589-5p 相對表達量等）以表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。計數資料（DCAF7 蛋白表達）用例（%）表示，采用χ2檢驗。Spearman 法分析分析織miR-589-5p 與DCAF7 的相關性。采用Kaplan-Meier法分析結直腸癌組織miR-589-5p、DCAF7 表達與病人預后的關系，行log-rank 檢驗；多因素Cox 回歸分析影響結直腸癌預后的因素。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Ualcan 數據庫中結腸腺癌組織和癌旁組織miR-589-5p、DCAF7表達水平比較Ualcan 數據庫中，結腸腺癌組織中miR-589-5p 表達水平低于癌旁組織（P＜0.001）；結腸腺癌組織DCAF7 表達水平高于癌旁組織（P＜0.001）。見圖1，2。

圖1 結腸腺癌癌旁組織與癌組織中miR-589表達水平比較

2.2 miR-589-5p、DCAF7 在結直腸癌組織上的表達水平與癌旁組織DCAF7 陽性表達率12.82%（10∕78）相比，結直腸癌組織中DCAF7 陽性表達率62.82（49∕78）相對表達水平較高（χ2=41.46，P＜0.001）。與癌旁組織相比，結直腸癌組織中DCAF7 mRNA 相對表達水平較高（P＜0.05），miR-589-5p 相對表達水平較低（P＜0.05），見表2。

表2 miR-589-5p在結直腸癌組織和癌旁組織表達水平比較∕

表2 miR-589-5p在結直腸癌組織和癌旁組織表達水平比較∕

注：miR-589-5p為微RNA-589-5p，DCAF7為CUL4相關因子7。

2.3 結直腸癌癌組織miR-589-5p 和DCAF7 表達水平的相關性根據miR-589-5p 平均值（0.44）將結直腸癌組織分為高表達組36 例（其中DCAF7 陽性表達12 例，陰性表達24 例），低表達組共42 例（其中DCAF7 陽性表達37 例，陰性表達5 例），經Spearman 相關分析顯示，組織中miR-589-5p 與DCAF7 表達水平呈負相關（r=-0.56，P＜0.05）。

2.4 miR-589-5p、DCAF7 表達與結直腸癌病人臨床病理特征的關系觀察結果顯示miR-589-5p、DCAF7 均與淋巴結轉移、腫瘤浸潤深度相關（P＜0.05），與病人年齡、性別、TNM分期、腫瘤長徑、組織分化程度無關（P＞0.05）。詳見表3。

表3 miR-589-5p、DCAF7表達與結直腸癌臨床病理特征的關系∕例（%）

2.5 miR-589-5p、DCAF7 表達與結直腸癌病人預后的關系Kaplan-Meier 法顯示miR-589-5p 高表達組生存時間為（32.06±1.30）個月，顯著長于miR-589-5p 低表達結直腸癌病人（24.25±1.73）個月，log Rank 檢驗，χ2=10.55，P=0.001。DCAF7 陰性表達生存時間為（31.51±1.55）個月，顯著長于DCAF7 陽性（25.52±1.59）個 月，Log Rank 檢 驗，χ2=6.22，P=0.013。見圖3。

圖2 結腸腺癌癌旁組織與癌組織中CUL4相關因子7（DCAF7）表達水平比較

圖3 miR-589-5p、CUL4相關因子7（DCAF7）表達水平與結直腸癌病人預后的關系：A為miR-589-5p表達水平與結直腸癌病人預后的關系；B為DCAF7表達水平與結直腸癌病人預后的關系

2.6 影響結直腸癌病人預后的因素分析單因素分析表明，腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移、miR-589-5p、DCAF7 均是影響結直腸癌病人不良預后的危險因素，見表4。多因素分析表明，淋巴結轉移（無轉移∕有轉移）HR及 其95%CI為1.80（1.10，2.96）（P=0.020）、miR-589-5p（高表達∕低表達）HR及其95%CI為1.92（1.26，2.93）（P=0.003）、DCAF7（陰性∕陽性）HR及其95%CI為1.80（1.20，2.81）（P=0.005）是影響結直腸癌病人不良預后的獨立危險因素（P＜0.05）。

表4 影響結直腸癌病人預后的危險因素分析

2.7 DCAF7 與miR-589-5p 在NCM460 細胞和SW837 細胞中表達水平比較NCM460 細胞組DCAF7 表達水平為1.02±0.09，miR-589-5p 表達水平為1.01±0.11，與NCM460 細胞比，SW837 細胞中DCAF7 的表達2.62±0.29 升高（t=11.78，P＜0.001），miR-589-5p 的表達0.36±0.06 降低（t=11.60，P＜0.001）。

2.8 各組SW837 中miR-589-5p、DCAF7 表達水平及細胞侵襲能力比較與Control 組比，miR mimic組miR-589-5p 表達顯著升高（P＜0.05），DCAF7 表達和侵襲細胞數顯著降低（P＜0.05）；與miR mimic 組比，miR mimic+pc-DCAF7組miR-589-5p表達差異無統計學意義（P＞0.05），DCAF7 表達和侵襲細胞數顯著升高（P＜0.05），見圖4，表5。

表5 結腸腺癌病人各組SW837細胞中miR-589-5p、DCAF7 mRNA表達水平及細胞侵襲能力比較∕

表5 結腸腺癌病人各組SW837細胞中miR-589-5p、DCAF7 mRNA表達水平及細胞侵襲能力比較∕

注：miR-589-5p為微小RNA-589-5p，DCAF7為CUL4相關因子7。①與Control組比較，P＜0.05。②與miR mimic組比較，P＜0.05。

圖4 結腸腺癌病人各組SW837細胞侵襲能力比較（結晶紫染色×200）

2.9 DCAF7 與miR-589-5p 靶向關系驗證TargetScanHuman 網址 預測DCAF7 與miR-589-5p 間存在結合位點，見圖5。雙螢光素酶報告基因結果顯示：與pmirGLO-DCAF7-wt+mimic NC 組相比0.99±0.12，SW837 細胞螢光素酶活性在pmirGLO-DCAF7-wt miR-589-5p mimic 組0.31±0.03 顯著降低（t=12.40，P＜0.001），與pmirGLO-DCAF7-mut+mimic NC組相比0.97±0.11，SW837 細胞螢光素酶活性在pmirGLO-DCAF7-mut miR-589-5p mimic 組0.99±0.14差異無統計學意義（t=0.25，P=0.808）。

圖5 結腸腺癌病人CUL4相關因子7（DCAF7）與微RNA（miR）-589-5p結合位點

3 討論

近年來我國結直腸癌的發病率和死亡率一直在增加［11-12］。尤其是中晚期結直腸癌病人［13-14］。目前，根治性手術是治療結直腸癌的有效方法，但早期病程隱匿及大多數結腸癌病人就診時已處于中晚期是病人預后差的主要原因［15］。已證實，一些腫瘤分子與結直腸癌病理特征及預后有密不可分的關系［16-17］。

本研究通過Ualcan 數據庫分析表明，結腸腺癌組織中miR-589 表達水平顯著低于癌旁組織，DCAF7 表達水平顯著高于癌旁組織，且本研究發現結直腸癌組織中DCAF7 陽性表達率及DCAF7 mRNA 相對表達水平較癌旁組織高，miR-589-5p 相對表達水平較癌旁組織低，表明本研究與Ualcan 數據庫分析結果一致，提示miR-589-5p、DCAF7 可能對結直腸癌發生有影響。Wu、Zhang［18］通過體外細胞實驗顯示，miR-589-5p 在腎細胞癌中作為LncRNA 賴氨酰氧化酶如1 反義RNA 1（LOXL1-AS1）分子海綿，高表達miR-589-5p 可抑制腎細胞癌的增殖和遷移，為腎細胞癌的治療開辟了新方向。Ji等［19］研究顯示miR-589-5p 在前列腺癌中下調，低表達miR-589-5p可通過靶向負調節趨化因子配體5而促進前列腺癌細胞的細胞遷移和侵襲。Misir 等［20］通過檢索GEPIA 數據庫分析表明，乳腺癌組織中DCAF7 陽性表達率明顯高于正常乳腺組織。本研究顯示結直腸癌組織中miR-589-5p 與DCAF7 表達水平呈負相關，miR-589-5p、DCAF7 均與淋巴結轉移、腫瘤浸潤深度相關，提示miR-589-5p 可能與DCAF7 共同影響結直腸癌病情進程。本研究發現miR-589-5p 高表達組病人平均生存時間顯著長于miR-589-5p 低表達結直腸癌病人，DCAF7 陰性表達病人平均生存時間顯著長于DCAF7陽性表達病人，miR-589-5p 低表達、DCAF7 陽性是影響結直腸癌病人不良預后的獨立危險因素，提示miR-589-5p、DCAF7 可能影響結直腸癌預后不良發生，有作為結直腸癌預后新分子標志物的潛力。本研究經過細胞學實驗證實，SW837 細胞中miR-589-5p 表達下調，DCAF7 表達上調，與miR-589-5p、DCAF7 在結直腸癌組織中研究結果一致，還證實miR-589-5p 與DCAF7 存在靶向關系，miR-589-5p 高表達抑制SW837 細胞侵襲，DCAF7 高表達可逆轉miR-589-5p高表達對SW837 細胞侵襲的抑制作用，表明miR-589-5p 高表達可能通過抑制DCAF7 表達來抑制SW83細胞的侵襲。

綜上所述，結直腸癌組織中miR-589-5p 呈低表達、DCAF7 呈高表達，與結直腸癌淋巴結轉移、腫瘤浸潤深度以及預后不良獨立危險因素，有望成為結直腸癌治療的新分子標志物。但本研究尚未深入探討miR-589-5p、DCAF7 與結腸癌預后不良病理機制的關系，仍需深入探討。

（本文圖1～4見插圖6-10）