采用間接法建立BV-VCA-IgA和EBV-EA-IgA定量檢測的參考區間

麥東媚 沈樂 譚俊青

1廣東省第二中醫院檢驗科，廣州 510000；2廣東江南醫院檢驗科，廣州 510000

近年來，我國鼻咽癌人數不斷上漲，特別是兩廣地區，鼻咽癌趨勢更是由北向南逐漸遞增。據研究，我國鼻咽癌發病人數占世界鼻咽癌患者的38.29%，鼻咽癌致死人數占世界鼻咽癌死亡人口的40.14%，發病率和病死率高于世界平均水平（1.2/10萬、0.7/10萬），且男性患鼻咽癌的比例遠高于女性［1］。其中，EB病毒與鼻咽癌有著密不可分的聯系，EB病毒衣殼抗原抗體（epstein-barr virus capsid antigen antibody，EBV-VCA-IgA）和 EB病毒早期抗原抗體（epstein-barr virus early antigen antibody，EBV-EA-IgA）水平抗體與鼻咽癌臨床表現有一定相關性，可應用于鼻咽癌的診療［2］。但鼻咽癌預后和治療情況復雜，患者治療后體內的EBV-VCA-IgA、EBV-EA-IgA和EBV-DNA水平會大幅減少，導致檢出率大幅度下降，這時候要通過這三項聯合檢查才能為鼻咽癌療效及預后提供一定的參考意義［3］。廣州地區是鼻咽癌高風險地區，所以能夠有一個準確檢測EBV-VCA-IgA與EBV-EA-IgA的指標對快速確診鼻咽癌與觀察鼻咽癌的治療愈后具有重要意義。

過去臨床實驗室是通過定性試驗確認機體是否感染有EB病毒的風險，這種方法存在假陰性或假陽性的可能，無法對患者體內EB病毒進行準確檢測。近幾年，臨床實驗室對EB病毒的定性試驗轉變為定量試驗。這種定量試驗可以更精準檢測患者體內的EB病毒抗原抗體含量，反應機體感染病毒的嚴重程度，為臨床篩查與治療提供更為準確的檢測結果。但是這種定量試驗運用到臨床檢驗上的時間并不長，大多數臨床實驗室還是直接使用試劑商提供的EBV-VCA-IgA和EBV-EA-IgA的參考區間。由于廣州地區居民的飲食、環境、生活習慣的不同，無法準確驗證試劑廠商提供的參考區間是否適用于廣州地區的居民［4］。因此，建立適用于本實驗室的EBV-VCA-IgA與EBV-EA-IgA的生物參考區間具有一定的臨床指導意義。

運用直接法去建立當地的生物參考區間［5］，于各地醫院是一個十分重要的診斷指標，但需要嚴格篩查患者樣本，程序復雜，十分費時且花費大，這對于醫學實驗室來說是一種巨大的負擔。而間接法建立生物參考區間是指運用臨床實驗室數據庫中已有的數據去建立生物參考區間的方法，相比于直接法，間接法更加方便、快速，為不同地區和不同等級的臨床實驗室降低了建立生物參考區間的難度［6］。因此，本次研究將運用間接法，通過收集并篩選廣東省第二中醫院2020年8月至2021年7月體檢健康人群的數據，建立本實驗室EBV-VCA-IgA及EBV-EA-IgA的生物參考區間，并參考WS/T 402—2012《臨床實驗室檢驗項目參考區間的制定》中推薦的方法［7］，選取廣東省第二中醫院2021年8月至10月的體檢健康人群參與驗證，按照本文研究數據的篩選標準篩選出參考區間對應的驗證數據，從中隨機取20個標本對其參考區間進行驗證，建立臨床較為適用的參考區間，提高臨床對EB病毒感染的確診率與及時反饋鼻咽癌患者的預后情況。

材料與方法

1.分析對象

研究所用到的體檢標本均來自廣東省第二中醫院實驗室信息管理系統（laboratory information management system，LIS）中2020年8月至2021年7月的體檢標本，運用Excel軟件篩選體檢標本信息中同時檢測了EBV-VCA-IgA、EBV-EA-IgA、血清天冬氨酸轉氨酶（AST）、血清丙氨酸轉氨酶（ALT）、總膽紅素（T-BILI）、直接膽紅素（D-BILI）、間接膽紅素（I-BILI）、血清肌酐（CR）及尿素氮（BUN）等的標本，共計有2 160例符合要求的體檢標本，其中男998例，女1 162例。本次研究僅對大于20歲、小于100歲的成年人進行研究。篩查標準：（1）體檢標本；（2）信息完整；（3）EB兩項（EBV-VCA-IgA、EBV-EA-IgA）、肝功五項（ALT、AST、T-BILI、I-BILI、D-BILI）、腎功二項（CR、BUN）結果正常的體檢標本。按年齡段區分為3個年齡組：20～50歲組、≥50～70歲組以及≥70歲組。20～50歲組1 135例，男558例，女 577例；≥50～70歲組 807例，男 359例，女448例；≥70歲組218例，男81例，女137例。

本研究經廣東省第二中醫院醫學倫理委員會審核批準，意見號：Z202303-004-01。

2.儀器與試劑

新產業MAGLUMI X8化學發光免疫分析儀、EBV-VCA-IgA和EBV-EA-IgA抗體檢測試劑盒均購自深圳市新產業生物醫學工程股份有限公司。

3.方法

3.1.質量控制 為了保證本次實驗數據準確可靠，必須要確認實驗所需要的儀器與試劑室內質控情況。經檢測得出一份關于EBV-VCA-IgA/EBV-EA-IgA性能驗證報告，EBV-VCA-IgA的實驗室變異系數（%）為Level 1（低水平）：3.978%，Level 2（高水平）：2.337%；EBV-EA-IgA的實驗室變異系數（%）為Level 1（低水平）：6.078%，Level 2（高水平）：4.131%。以上兩項目的變異系數都低于廠商提供的變異系數10%，證明本次結果均符合實驗室中的質控標準。

3.2.數據導出 體檢標本包括EBV-VCA-IgA、EBV-EA-IgA、ALT、AST、T-BILI、I-BILI、D-BILI、CR、BUN的體檢標本信息、性別以及檢測結果，并且以患者ID號為唯一標準，刪除重復與信息缺失的數據結果。

3.3.數據剔除 運用K-S檢驗對各性別組以及年齡組進行正態性分析，P＞0.05為正態分布，P＜0.05為非正態分布。對于非正態分布的組別需要用非參數法進行檢驗，運用統計學分析得出各組別的上下四分位數（P75，P25），計算各組的四分位間距（IQR），并且繪制箱式圖，剔除大于P25-3×IQR和小于P75+3×IQR的數據。

3.4.數據分組 對EB病毒的兩個檢測項目先進行性別分組，兩組比較使用Mann-WhitneyU檢驗，再進行年齡分組，年齡組分為20～50歲組、≥50～70歲以及≥70歲這3個組別（各組數據均符合WS/T 402-2012《臨床實驗室檢驗項目參考區間的制定》中規定最少檢測數量為120例）［7］。3組及以上使用Kruskal-Wallis（K-W）秩和檢驗，3組及以上的兩兩比較使用DunnettT3檢驗。對差異無統計學意義（P＞0.05）的年齡組進行合并分析，若再無統計學意義便暫時不考慮建立該組的生物參考區間。對差異有統計學意義（P＜0.05）的年齡組分別建立生物參考區間。

3.5.建立生物參考區間 根據性別與年齡組進行分組篩選，對結果進行正態性檢驗，比對組間VCA-IgA和EA-IgA的水平是否存在差異。繪制箱式圖對于非正態分布的結果進行離群值的剔除后，選用非參數法檢驗計算出第2.5個百分位數（P2.5）作為VCA-IgA和EA-IgA生物參考區間的上限值，第97.5個百分位數（P97.5）作為VCA-IgA和EA-IgA生物參考區間的下限值。

3.6.驗證生物參考區間 參照WS/T 402-2012《臨床實驗室檢驗項目參考區間的制定》中推薦的方法［7］，隨機抽取20例2021年8月的體檢健康人群標本進行驗證，如果檢測結果中有90%以上的結果均分布在新建立的參考區間范圍內，則證明該生物參考區間適用。如果第1次試驗不通過驗證，則需要重新篩選20例標本進行2次驗證，如再次驗證失敗，證明該生物參考區間不適用。

4.統計學方法

運用 SPSS 20.0中的 Kolmogorov Smirnov（K-S）檢驗對各性別組以及年齡組進行正態性分析，P＞0.05為正態分布，P＜0.05為非正態分布，得出的結果結合K-S檢驗的統計結果可分析出，男女性別組及年齡組的檢驗結果是否為正態分布，如數據分析后呈正態分布，則可以使用參數檢驗對其進行分析；若結果非正態分布，則使用非參數檢驗中Mann-WhitneyU檢驗分析男女性別差異是否有統計學意義，再繪制箱式圖，剔除離群值。男女性別組間比較使用Mann-WhitneyU檢驗；年齡組間比較則使用非參數檢驗中K-W秩和檢驗法并使用Dunnett T3法進行兩兩比較。以P＜0.05為差異有統計學意義

結 果

1.各項數據的分布情況

將篩查分類后的各組EBV-VCA-IgA和EBV-EA-IgA數據進行K-S檢驗，結果如圖1～3所示，各組數據均呈偏態分布，使用非參數檢驗法。同時，建立各組數據的箱式圖，根據箱式圖剔除離群值，用非參數檢驗各組間差異。

圖2 2 189例健康體檢人群按年齡分組的EB病毒早期抗原抗體（EBV-EA-IgA）、EB病毒衣殼抗原抗體（EBV-VCA-IgA）數據直方圖。A為20～50歲組EBV-EA-IgA數據，B為20～50歲組EBV-VCA-IgA數據，C為≥50～70歲組EBV-EA-IgA數據，D為≥50～70歲組EBV-VCA-IgA數據，E為≥70歲組EBV-EA-IgA數據，F為≥70歲組EBV-VCA-IgA數據

圖3 EB病毒衣殼抗原抗體（EBV-VCA-IgA）男女年齡組數據的直方圖。A為20～50歲組男性EBV-VCA-IgA數據，B為20～50歲組女性EBV-VCA-IgA數據，C為≥50～70歲組男性EBV-VCA-IgA數據，D為≥50～70歲組女性EBV-VCA-IgA數據，E為≥70歲組男性EBV-VCA-IgA數據，F為≥70歲組女性EBV-VCA-IgA數據

2.分析性別組間的參考區間

運用Mann-WhitneyU檢驗，對EBV-VCA-IgA和EBV-EA-IgA性別結果分別進行分析，結果顯示EBV-VCA-IgA 性 別 差 異 有 統 計 學 意 義（P＜0.001），EBV-EA-IgA性別差異無統計學意義（P=0.127），證明EBV-VCA-IgA的生物參考區間需要區分性別。

3.分析各項目年齡組間的參考區間

EBV-EA-IgA性別差異無統計學意義，EBV-VCA-IgA男女性別間差異有統計學意義。因此，EBV-EA-IgA項目按20～50歲、≥50～70歲及≥70歲分成3組，EBV-VCA-IgA項目在性別分組的基礎上分別按20～50歲、≥50～70歲及≥70歲分成3組。將各個項目的年齡組間進行非參數檢驗中獨立樣本K-W秩和檢驗法得出，EBV-VCA-IgA、EBV-VCA-IgA男性、EBV-VCA-IgA女性年齡組別間，差異均無統計學意義（P=0.087、0.294、0.087），所以不需要建立年齡分組的參考區間。僅有EBV-EA-IgA年齡組之間差異有統計學意義（P=0.004），即EBV-EA-IgA年齡組需要將其分別進行參考區間的建立。接著，使用Dunnett T3法對EBV-EA-IgA的年齡分組進行兩兩比較。如圖4所示，20～50歲與≥50～70歲組之間，差異無統計學意義（P＞0.05），其他兩兩比較差異均有統計學意義（P=0.002、P＜0.001），故合并為一組（20～70歲），與≥70歲組比較，差異有統計學意義（P=0.001）。

圖4 2 189例健康體檢人群按年齡分組后組間EB病毒早期抗原抗體（EBV-EA-IgA）比較

另外，通過擬合線性的散點圖（圖5）可以看出，EBV-EA-IgA隨年齡增長其檢測值有所增高，主要反映在女性人群。而EBV-VCA-IgA無論男性或女性均無明顯趨勢。

圖5 各項目組的擬合線性散點圖。A為2 160例健康體檢人群的EA-IgA擬合線性散點圖，B為男性的EA-IgA擬合線性散點圖，C為女性的EA-IgA擬合線性散點圖，D為2 160例健康體檢人群的VCA-IgA擬合線性散點圖，E為男性VCA-IgA擬合線性散點圖，F為女性的VCA-IgA擬合線性散點圖

4.生物參考區間的建立

由于此次建立生物參考區間是使用的間接法，所以要使用非參數檢驗對本次結果的2.5百分位數和97.5百分位數的數據作為生物參考區間。離群值經剔除后，對差異有統計學意義的組別進行P2.5和P97.5分布點位的計算，根據百分位數（P2.5～P97.5）建立各個組別的生物參考區間，分別是EBV-VCA-IgA：男性0.34～3.88 AU/ml，女 性 0.32～3.71 AU/ml；EBV-EA-IgA：20～70 歲 ：0.01～1.39 AU/ml，≥70歲：0.01～1.52 AU/ml（廠家提供的生物參考區間EBV-VCA-IgA為0～4、EBV-EA-IgA為0.00～3.00）。

5.生物參考區間的驗證

使用隨機抽樣法抽取2021年8月至10月的符合條件的體檢標本，對有年齡分組的生物參考區間進行年齡分層隨機抽樣法抽取體檢標本，對有性別分組的生物參考區間進行性別分層隨機抽樣法抽取體檢標本。為各組的生物參考區間隨機抽取20例標本進行驗證，驗證以18個以上的結果在建立的參考區間內為通過，驗證次數不能多于2次。運用Excel軟件，進行驗證各組參考區間的可靠性，EBV-VCA-IgA男性組、EBV-VCA-IgA女性組、EBV-EA-IgA 20～70歲組、EBV-EA-IgA≥70歲組的生物參考區間通過驗證要求。所以，此次研究建立的生物參考區間驗證通過，符合臨床實驗室標準要求。

討 論

使用直接法建立的生物參考區間相對間接法來說更可靠且適用，這也是國際臨床實驗室標準推薦的建立生物參考區間方法［5］。但對直接法來說，健康人群選擇是一個很復雜的問題，根據不同項目組合去篩選健康人群與因不同疾病在不同人群中產生的亞臨床狀態，這些細微的差異都會直接引起生物參考區間的差異。長此以往，諸多不便利的因素使國內的臨床實驗室仍在使用試劑廠商提供的參考區間，特別是購入國外廠商的試劑，他們是根據外國人的身體檢查數據所建立的生物參考區間，與國內人群因飲食、文化、生活環境的差異導致兩者會產生兩種截然不同的參考區間。在Fraser［8］報道中，也指出了各個項目的生物參考值并不是一個固定的常數，其中生物與生俱來的變異性對每個臨床檢驗項目都造成了一定影響。我國衛生部門在2012年頒布了一套生化與血常規部分項目的標準后，國內的臨床實驗室才有了較為規范的行業標準。

用間接法建立生物參考區間需要以大量數據為基礎，所以，這次使用的體檢人群數據結果會存在一定數量的離群值，間接法的弊端之一就是離群值［9］。建立參考區間需要將離群值剔除，本次實驗數據均為非正態分布，采用箱式圖將離群值剔除。觀察近幾年各文章所使用的方法［10-11］，不同剔除方式都有不同的適用范圍，應根據數據的分布與數量進行篩選合適的剔除方式。本研究采取了大于P25-3×IQR和小于P75+3×IQR作為數據剔除標準。

廣州是鼻咽癌高風險地區，EB相關定量檢測的生物參考區間建立未見相關報道。因此，本次研究的主旨在于能夠初步建立本實驗室EBV-VCA-IgA及EBV-EA-IgA定量檢測的生物參考區間。檢測EBV-VCA-IgA、EBV-EA-IgA等EBV相關抗體是篩查和輔助診斷常用方法。對于EB病毒抗原抗體來說，其臨床意義在于當檢測的數值高于參考區間提供的上限時，提示機體可能存在潛在的鼻咽癌風險或反映鼻咽癌的治療預后效果［12］。所以EBV-VCA-IgA和EBV-EA-IgA的參考區間上限比下限更具有臨床意義，與廠家推薦的參考區間上限進行比較，發現新建立的參考區間范圍更加精準，測量范圍更小。

本研究發現，EBV-VCA-IgA在性別分組差異有統計學意義，并且男性的參考范圍上限值比女性偏高。另外，EBV-VCA-IgA在年齡分組上差異無統計學意義，故未作下一步分組。EBV-EA-IgA在性別分組上差異無統計學意義。據研究，EBV-EA-IgA在不同年齡段的陽性率差異有統計學意義，其中，中老年區間EBV-EA-IgA的陽性率較高［13］。這與本文研究結果一致，EBV-EA-IgA在年齡分組上差異有統計學意義，并劃分了20～70歲及≥70歲的年齡段參考范圍，并呈現出隨著年齡增長而增長的趨勢（圖4），提示EBV-EA-IgA在健康人群中可能會隨著年齡的變化而變化。因此，對于不同年齡段的人群可能應選擇不同的診斷界值，才能提高患者的診斷率。而EBV-VCA-IgA不會因年齡的變化而大幅度波動（圖4），因此不需要建立年齡分組的參考區間。

據李曉華等［14］報道，健康人群中EBV-VCA-IgA的男女間rA值比較差異無統計學意義，與本文研究的結果不一致。分析原因如下：一，檢測方法不一致，李曉華等研究的方法是ELISA（定性），而本文研究的是化學發光法（定量）；二，本研究無法完全篩除體檢標本中可能存在的慢性病、遺傳病以及各類疾患等；三，標本數量不夠多，無法抹去因實驗數據不足帶來偏移的可能；四，在用間接法建立生物參考區間時，我們沒有使用兩種或以上的檢驗方法，以得出更符合臨床實驗室的生物參考區間。另外，我們分析數據發現EBV-VCA-IgA的男女參考區間上限值差異不大。考慮到分組的意義，其性別分組的參考區間尚待進一步完善和驗證。

結 論

目前，大部分醫院檢驗科的信息化建設已逐漸完善，利用間接法驗證和建立參考范圍的條件已逐漸成熟。本研究利用間接法初次建立本實驗室EBV-VCA-IgA與EBV-EA-IgA的生物參考區間，結果表明，廠家推薦的參考區間可能不適用于所有地區及人群，利用實驗室大數據進行參考區間的建立和驗證具有一定的研究價值。本研究得出的EBV-VCA-IgA、EBV-EA-IgA性別及年齡分組的參考區間具有一定的實際意義與參考價值。但由于標本數量不足、篩選標準不夠嚴格等，無法建立更精確的生物參考區間。同時，單一的方法學檢驗存在的缺陷，也沒有使用其他檢驗方法進行彌補。所以，此次建立的生物參考區間不夠完善，為本實驗室提供更為準確的EBV-VCA-IgA與EBV-EA-IgA生物參考區間還需要進一步完善和驗證。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻聲明麥冬媚：醞釀和設計試驗，起草文章，對文章的知識性內容作批評性審閱，統計分析；沈樂：采集數據，分析/解釋數據；譚俊青：指導，支持性貢獻