基于網絡藥理學探討健胃消脹片治療胃腸動力障礙性疾病的作用機制

莫綺君，盧漢祺，陳翻享，方笑媚

在重癥監護室（ICU），重癥患者的營養支持與預后緊密相關，合理的營養支持可以促進患者恢復，提高免疫力，盡早脫離呼吸機，縮短患者在ICU的住院時間，減少并發癥發生率及死亡率［1］。但ICU 患者，尤其老年患者常存在多種基礎病，合并多器官衰竭，當面對感染、創傷、手術等應激狀態，常會出現免疫失調、持續炎癥、代謝分解異常等情況［2］。患者在重癥下常合并胃腸動力障礙，故盡早恢復腸道正常動力功能對促進ICU 患者的康復和預后至關重要。

胃腸動力障礙性疾病（DGIM）是指由胃腸動力紊亂引起的以惡心、嘔吐、胃潴留、胃癱、排便異常等各種消化道癥狀為臨床表現的疾病［3］。胃腸動力紊亂是其主要的病理生理機制，具體發病機制尚在研究中，包括胃腸Cajal 間質細胞（ICC）、胃腸激素和5-羥色胺（5-HT）、腸壁微血管病變和微循環障礙、代謝紊亂等腸壁神經、調節因子或細胞研究及中樞神經系統“腦-腸軸”的調節作用［3-4］。胃腸動力障礙歸屬中醫“痞滿”等范疇，在《內經》《傷寒論》《諸病源候論》等諸多經典中均有訴述。中醫在中藥、針灸等方面對胃腸動力障礙治療有豐富經驗和良好療效。

健胃消脹片為東莞中醫院院內制劑，是根據通降胃氣之法創立，有行氣消痞、調和氣血的功用。其以枳殼、大腹皮、沉香為君藥行氣消脹，雞內金、山藥健脾胃以降胃氣，莪術活血祛瘀，行補藥之滯，紫蘇梗順氣和胃，兼升清脾氣，旱蓮草、石斛清胃熱而養胃陰，調和前藥之溫性，甘草調和諸藥［5］。臨床已證實其對慢性胃炎、功能性消化不良、潰瘍病等有較好的治療效果。由于中藥復方治療疾病是通過其中的有效成分綜合作用的，運用網絡藥理學整合系統生物學、網絡分析及多向藥理學等多學科技術，可從新的角度研究中藥復方的藥效物質基礎及藥理作用機制。

1 材料與方法

1.1 獲取中藥活性成分及靶點 健胃消脹片（粵藥制字：Z20110147）主要由枳殼、大腹皮、雞內金、山藥、莪術、紫蘇、旱蓮草、石斛、甘草組成，利用中藥系統藥理分析平臺（https：//tcmspw.com/tcmsp.php，TCMSP）［6］，以主要成分名稱為關鍵詞檢索，根據生物口服利用度（OB）≥30% 和類藥性（DL）≥0.18［7］篩選候選化合物，候選化合物通過TCMSP 和Drugbank 數據庫收集相應的靶點信息。靶點命名通過Uniprot 數據庫（https：//www.uniprot.org/）進行標準化。

1.2 獲取胃腸動力障礙疾病靶點 在Genecards（https：//www.genecards.org/）數據庫和在線人類孟德爾遺傳（OMIM）數據庫（https：//www.omim.org/）以疾病關鍵詞“DGIM”進行檢索，得到DGIM 的疾病靶點。

1.3 獲取中藥-疾病共同靶標并繪制維恩圖 將健胃消脹片中9 味中藥的作用靶點與DGIM 的疾病靶點導入維恩圖（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）取交集，篩選出DGIM 與健胃消脹片的交集靶點，并繪制維恩圖。

1.4 構建“化合物-交集靶點”網絡圖 獲取交集靶點后，對化合物進行反向篩選，剔除不含交集靶點的藥物成分，根據上述得到的健胃消脹片活性成分及其對應靶點，在Excel 表格中建立相互對應的關系，導入Cytoscape 3.7.2 軟件中，構建健胃消脹片治療DGIM 的“成分-交集靶點”網絡藥理圖［8］。

1.5 蛋白質相互作用網絡圖 將獲得的交集基因上傳到STRING（https：//string-db.org/）數據分析平臺進行蛋白質相互作用分析。數據分析模式設定為“Multiple proteins”，物種設定為“Homo sapiens”，導出圖像及數據。運用Cytoscape3.7.2 軟件繪制蛋白質相互作用網絡（PPI）圖，依據度值對蛋白質進行排列。

1.6 GO 和KEGG 富集分析 將得到的藥物與疾病交集靶點上傳至DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）平臺，設置物種為“Homo sapiens”，設置篩選條件為“official gene symbol”。對健胃消脹片的作用靶點進行基因本體（GO）功能富集分析以及京都基因和基因組百科全書（KEGG）代謝通路富集分析。以P＜0.05 為篩選條件得出排名靠前的生物過程和通路，并對數據結果進行可視化。

1.7 分子對接 挑選“化合物-交集靶點”網絡圖中節點排名在前5 的化合物，將其分別與蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）圖中度值排名前6 的核心蛋白質分子進行分子對接。首先利用Pubchem（https //pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）及PDB 數據庫（https：//www1.rcsb.org/）分別下載3 種化合物sdf 格式的3D 結構文件和蛋白質大分子的pdb 格式文件；使用OpenBable 2.3.1 軟件把活性化合物的3D 結構文件由sdf 格式轉化為mol2 格式；利用Pymol 軟件去除蛋白質大分子的水分子和配體，并把蛋白質大分子的3D 結構保存為pdb 文件；最后用Autodock-Tools 軟件對蛋白質分子與活性成分分子進行分子對接；利用Pymol 2.3.1 軟件進行對接結果的優化及可視化。

2 結果

2.1 健胃消脹片的活性成分及靶點 通過TCMSP數據庫，設定OB≥30%，DL≥0.18 為篩選條件，最終得到健胃消脹片候選化學物136 個。見表1。根據136 個健胃消脹片候選化學物，通過TCMSP 數據庫和Drugbank 數據庫分別獲取2 356 和39 個靶點信息，共得到2 395 個靶點。

表1 健胃消脹片136 個候選化學物基本信息

續表

續表

續表

2.2 中藥-疾病共同靶標 通過Genecards 和OMIM 數據庫分別得到“DGIM”的疾病靶點有998 個和35 個，共1 033 個疾病靶點。維恩圖分析顯示健胃消脹片成分靶點與DGIM 的疾病靶點共有192 個交集靶點。見圖1。

圖1 健胃消脹片與DGIM 交集靶點

2.3 “化合物-交集靶點”網絡圖 利用交集靶點反向篩選出136 個化合物，篩選出化合物后利用Cytoscape 3.7.2 軟件構建“化合物-交集靶點”網絡圖。圖中共有326 個節點，1 648 條邊，其中有143 個藥物成分節點，183 個靶節點。見圖2。根據節點連線數值篩選出排名前9 的主要成分為β-谷甾醇（MOL000358）、芒柄花黃素（MOL000392）、異鼠李素（MOL000354）、山柰酚（MOL000422）、木犀草素（MOL000006）、槲皮素（MOL000098）、7-乙酰氧基-2-甲基異黃酮（MOL004991）、柚皮素（MOL004328）、川陳皮素（MOL005828）。

圖2 化合物-交集靶點網絡圖

2.4 PPI 網絡圖 PPI 網絡圖顯示共有191 個節點，4 110 條邊，平均節點數為21.518。圖中節點代表靶蛋白，邊則代表靶蛋白之間的相互作用關系。在191 個節點中，節點連線數值排名前10 的有羥色胺（HT）、胰島素樣生長因子（IGF）、白細胞介素（IL）、一氧化氮合成酶（NOS）、腫瘤壞死因子（TNF）、血管活性腸肽（VIP）、白蛋白（ALB）、蛋白激酶1（AKI-1）、血管內皮生長因子A（VEGFA）、表皮生長因子受體（EGFR）。見圖3。提示以上靶點在健胃消脹片治療DGIM 中起到關鍵的作用。

圖3 藥物-疾病PPI 網絡圖

2.5 GO 功能分析結果 利用DAVID 數據庫對健胃消脹片治療DGIM 的靶點進行GO 功能富集分析。設定P＜0.05 和FDR＜0.05 為篩選條件，共得到2 623 條GO 條目，其中生物過程（BP）條目2 349條，細胞組成（CC）條目102 條，分子功能（MF）條目172 條。分別選取BP、CC、MF 分析排名前20 條目進行數據可視化，BP 過程主要包括信號轉導、基因表達調節、藥物反應等；CC 主要包括細胞膜、細胞表面、細胞外基質、細胞核等；MF 主要包括與蛋白結合、ATP 結合、酶結合、受體結合等。見圖4～6。

圖4 健胃消脹片治療DGIM 的GO BP 分析

圖5 健胃消脹片治療DGIM 的GO CC 分析

圖6 健胃消脹片治療DGIM 的GO MF 分析

2.6 KEGG 通路富集分析 通過DAVID 在線數據庫對健胃消脹片與DGIM 的交集靶點進行KEGG通路富集分析。共得到174 條相關通路，取排名前20 的通路。見圖7。與胃腸動力障礙相關的信號通路主要有磷脂酰肌醇3 激酶/絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶（P13K/Akt）信號通路、HIF-1 信號通路、TNF 信號通路、IL-17 信號通路等。

圖7 健胃消脹片治療DGIM 的KEGG 通路富集分析

2.7 分子對接結果 把化合物-交集靶點網絡圖中節點數排名前5 的化合物和PPI 網絡圖中度值前6的蛋白質分子通過AutodockTools 軟件進行分子對接。對接越穩定的配體和受體結合能越低，由分子對接的結果可推測5 種化合物能與PPI 中的核心靶點蛋白結合成穩定的構象。見表2。圖8 為健胃消脹片核心成分和關鍵靶點分子對接的構象。

圖8 健胃消脹片核心成分和關鍵靶點分子對接結合圖

3 討論

本研究通過TCSMP 中藥系統藥理學分析平臺及TCMID 中藥綜合數據庫篩選出健胃消脹片136 個活性成分，構建了健胃消脹片與DGIM 的化合物-交集靶點網絡圖，通過篩選得到健胃消脹片的活性成分主要有β-谷甾醇、芒柄花黃素、異鼠李素、山柰酚、木犀草素等。β-谷甾醇是大腹皮、枳殼、紫蘇的活性成分，芒柄花黃素、山柰酚、異鼠李素是甘草的活性成分，木犀草素是紫蘇、旱蓮草的活性成分。β-谷甾醇是動、植物細胞膜的主要組成成分，表現出抗炎、抗腫瘤、抗潰瘍等廣泛生物活性。β-谷甾醇可能通過降低胃潰瘍大鼠胃組織ET-1 mRNA 表達水平，升高大鼠胃組織甲狀腺轉錄因子（TTF）-1、TFF-2 mRNA 水平，發揮胃黏膜保護作用［9］。有小鼠實驗研究表明，β-谷甾醇可能通過核因子κB（NFκB）通路抑制炎癥因子的表達，緩解急性結腸炎［10］。芒柄花黃素能有效地降低小鼠體內丙二醛（MDA）活性，提高超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）的活性，減少氧自由基的生成［11］。異鼠李素是槲皮素的代謝產物，較后者更易代謝和吸收，可能是通過抑制表皮生長因子受體（EGFR）的磷酸化，通過絲裂原活化蛋白激酶激酶1/磷脂酰肌醇3-激酶（MEK1/PI3K）信號轉導通路，誘導結腸癌細胞凋亡［12］。另外有研究發現，異鼠李素通過抗炎、抗氧化應激、抗凋亡以保護內皮細胞［13］。山柰酚亦有抗腫瘤、抗氧化和抗炎等作用［14］。木犀草素在新生老鼠壞死性小腸結腸炎模型中可以通過抑制下調NFκB 蛋白表達，減少促炎因子TNF-α 的釋放，上調抑炎因子IL-10 的表達，避免腸管黏膜進一步損害［15］。

通過構建PPI 網絡圖，篩選得到健胃消脹片治療DGIM 的主要靶點有HT、IGF、IL、NOS、TNF、VIP。90%以上5-HT 由腸道合成，可以調節腸道多種功能，是腦-腸軸的關鍵神經遞質。有研究表明，慢性便秘患者腸道菌群可以通過增加實驗組小鼠腸道組織5-羥色胺轉運體（SERT）表達，降低5-HT水平，從而減慢小鼠腸道運動，影響排便［16］。IGF-1主要來源于肝臟合成和腸道，可以促進細胞增殖、分化，抑制細胞凋亡，能有效促進腸道上皮細胞的增殖［17］。TNF-α 為炎癥啟動因子，IL-6 為一種促炎細胞因子，生理狀態下調節多重免疫，維持機體生理平衡。當抑炎因子與促炎因子的平衡遭到破壞，引發胃腸黏膜炎癥發生，潰瘍性結腸炎患者體內IL-6、TNF-α 升高，更易發生菌群失調［18］。在腸道NO、VIP 均作為抑制性神經遞質。NOS 作用是催化左旋精氨酸產生NO，實驗表明通過降低大鼠結腸的NOS 表達，減少NO 生成，解除平滑肌抑制，恢復腸道蠕動功能［19］。另外VIP 在胃腸道可通過作用于受體VPAC1 調節胃酸及胃腸激素的分泌、血管舒張、調節腸道炎癥反應等［20］。如VIP 通過VPAC1/Akt 信號通路抑制潰瘍性結腸炎的腸道炎癥反應，抑制上皮細胞凋亡，促進增殖［21］。

KEGG 分析結果顯示，主要涉及PI3K/Akt 信號通路、HIF-1 信號通路、TNF 信號通路、IL-17 信號通路、Th17 細胞分化等。信號通路在人體生理或病理進展過程中均十分重要，還可能是疾病治療的靶點［22］。PI3K/Akt 信號通路通過活化NF-κB，促炎因子表達增加，增強TNF-α 釋放，促進腸道炎癥反應［23］。另外PI3K/Akt 信號通路可以誘導腸上皮細胞自噬，介導細胞凋亡或壞死［24］，通過抑制該通路可以減輕腸道炎癥，保護腸上皮細胞，恢復腸道屏障。山柰酚可抑制人結直腸癌RKO 細胞增殖并誘導其凋亡，同時可能通過下調PI3K/Akt/mTOR 信號通路降低PI3K、p-Akt 和p-mTOR 蛋白表達，誘導RKO 細胞自噬［25］。木犀草素通過PI3K/Akt 通路抑制結直腸癌細胞系HCT116 細胞表達基質金屬蛋白酶9（MMP9）并下調其酶活性［26］。HIF-1α 是調節體內氧穩定的關鍵轉錄因子。在生理狀態下，腸道黏膜中HIF-1 的表達較少或者未表達。在病理狀態下，如缺氧應激時血液重分配，腸道血液灌流量急劇下降，造成局部缺血缺氧，HIF-1 的表達增加，炎癥介質如TNF-α、IL-6 增多，促進炎癥反應［27］，影響腸道屏障的正常生理功能。在急性胃腸功能障礙的發展中TNF-α 具有重要作用。TNF-α 作為炎癥介質，能損傷內皮細胞，引起微血管廣泛受損的同時可導致血液流變學紊亂［28］。相關研究發現TNFα 信號通路在一定程度上參與了急性胰腺炎的胃腸動力障礙，TNF-α 升高會造成腸黏膜缺血再灌注的損傷，加重腸黏膜的氧化應激反應，促進細胞凋亡脫落，TNF 水平升高，升高幅度越大，胃腸動力障礙越嚴重［29］。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學對健胃消脹片治療DGIM 的作用機制進行系統分析，發現健胃消脹片中的β-谷甾醇、芒柄花黃素、異鼠李素、山柰酚、木犀草素等成分直接作用在HT、IGF、IL、NOS、TNF、VIP 等相關靶點，通過PI3K/Akt、HIF-1、TNF等信號通路，發揮抗炎、調控細胞因子的作用，恢復腸道屏障，促進胃腸功能恢復，體現了多靶點協助的調節作用。