動物模型研究炎癥小體在海水淹溺誘發過敏性鼻炎中的作用

周燁，郟凱威，李云暉，侯晉，楊子軒

海水淹溺是航海作業中的常見事故，特別是在海上作戰或海上救援時，在落水人員中多有發生。海水含大量氯化鈉和鈣鎂鹽類的高滲液體，對鼻黏膜、呼吸道和肺泡有強烈的化學刺激作用，可引起機體產生多種細胞因子和趨化因子介導的炎癥反應，因此海水淹溺嚴重者可形成海水淹溺型肺損傷（seawater drowning induced acute lung injury，SWALI）或海水淹溺型急性呼吸窘迫綜合征（seawater drowning induced acute respiratory distress syndrome，SW-ARDS）［1-2］。與此同時，在航海過程中，環境變化、氣候影響、工作強度均在一定程度上會對海軍官兵的免疫力造成影響，增加海水侵入鼻黏膜后引起過敏性鼻炎（allergic rhinitis，AR）的患病風險，不僅影響官兵的正常工作和生活，還可誘發并發癥，如過敏性哮喘、鼻竇炎，影響官兵的身心健康，嚴重時會影響官兵正常訓練［3］。既往研究發現，在體外采用高滲鹽溶液處理原代鼻腔上皮細胞可引起鼻黏膜纖毛和屏障受損［4］，提示海水淹溺很可能造成患者鼻黏膜損傷，引起炎癥。本課題組前期研究發現，炎癥小體在小鼠AR 的發病過程中發揮重要作用［5］，然而海水淹溺誘發AR 發病的過程尚未闡明，炎癥小體是否在其中發揮重要作用亦未知。筆者通過構建小鼠海水淹溺誘發過敏性鼻炎（seawater drowning induced allergic rhinitis，SW-AR）模型，研究AR 癥狀伴隨的炎癥小體活化變化趨勢，通過使用抑制劑，觀察SW-AR 的發病情況，以期為臨床治療提供潛在靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗小鼠 雄性Balb/c 小鼠15 只，8 周齡，體重20～25 g，購買于上海必凱實驗動物公司，在SPF 級環境下飼養于海軍軍醫大學實驗動物中心，適應性飼養1 周。15 只Balb/c 小鼠按數字表法隨機分為3 組，每組5 只。

1.2 主要試劑 PrimeScript 反轉錄試劑盒、SYBR Premix ExTaq 實時熒光定量PCR 試劑盒、組織總RNA 抽提試劑Trizol 均購自TAKARA 公司。海水采樣自東海海域，其中主要電解質含量：Na+460 mmol/L，K+8.5 mmol/L，Cl-518 mmol/L，Mg2+6.2 mmol/L，Ca2+5.1 mmol/L，pH 值8.2。卵清蛋白（OVA）腹腔注射致敏工作液（1 mg/ml）：無菌條件下稱取1 mg OVA 粉劑，溶于1 ml 生理鹽水，按1∶1 的比例與Imject?Alum 混合，充分混勻，4 ℃保存。炎癥小體活化抑制劑Belnacasan（VX-765）購自Selleck（S2228），Belnacasan 溶 解 于 含2% DMSO 和30% PEG 300 的雙蒸水中，終濃度5 mg/ml［5-6］。

1.3 不同組小鼠處理方法 小鼠預先致敏，第0、7、14 天進行3 次腹腔注射OVA 工作致敏液，注射劑量每次100 μl/只。空白對照組不處理；SW-AR組小鼠鼻腔內滴入40 μl 海水/只，10 min 后給予小鼠滴鼻OVA（50 mg/ml，20 μl/只），每天1 次，連續進行3 d；抑制劑組小鼠鼻腔內滴入40 μl 海水/只，10 min 后給予小鼠滴鼻OVA（50 mg/ml，20 μl/只），10 min 后滴鼻炎癥小體活化抑制劑Belnacasan（5 mg/ml，20 μl/只），1 次/d，連續進行3 d。

1.4 觀察指標 （1）分別于建模1 h 后，觀察記錄撓鼻/噴嚏癥狀。其中撓鼻定義為小鼠前爪抓撓鼻部或四處摩擦，將小鼠放置于一空框，分別記錄10 min 內小鼠撓鼻和噴嚏的次數。（2）取鼻黏膜組織，使用Trizol 試劑提取總RNA［7］。實時熒光定量PCR 檢測鼻黏膜組織中白細胞介素（interleukin，IL）-6、IL-1β、IL-18 mRNA 水平的表達，以β-actin 作為內參。IL-6 檢測引物forward：5＇-TAG TCC TTC CTA CCC CAA TTT CC -3＇，reverse：5＇- TTG GTC CTT AGC CAC TCC TTC-3＇；IL-1β 檢 測 引 物forward：5＇-GGT GTG TGA CGT TCC CAT TAG AC-3＇，reverse：5＇-CAT GGA GAA TAT CAC TTG TTG GTT GA-3＇；IL-18 檢測引物forward：5＇-GAC TCT TGC GTC AAC TTC AAG G-3＇，reverse：5＇-CAG GCT GTC TTT TGT CAA CGA-3＇；β-actin 檢測引物forward：5＇-AGT GTG ACG TTG ACA TCC GT-3＇，reverse：5＇-GCA GCT CAG TAA CAG TCC GC-3＇。（3）眼球取血，酶聯免疫吸附實驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測小鼠血清中IL-18 蛋白水平，按照說明書進行操作。（4）取鼻黏膜組織，使用蘇木精-伊紅（Hematein Eosin，HE）染色小鼠鼻黏膜組織切片，觀察病理切片結果。（5）取鼻黏膜組織5 mg，提取總蛋白，Western blotting 檢測炎癥小體活化程度，含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase）-1 p20 和gasdermin-D（GSDMD）活化情況。

1.5 統計學處理 采用Graphpad Prism 8 進行數據統計分析。Western blotting 結果量化使用Image J 軟件完成，以β-actin 為內參。計量資料采用表示，組間采用非配對t檢驗分析。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠AR 行為學特征及鼻黏膜組織HE 染色比較 結果顯示，SW-AR 組小鼠撓鼻和噴嚏次數明顯多于對照組（P＜0.01），見表1。同時SW-AR組鼻黏膜組織出現明顯損傷，上皮細胞排列紊亂，纖毛上皮存在部分脫落現象。AR 行為學特征和組織切片染色結果證實模型構建成功，見圖1。與SW-AR 組比較，抑制劑組小鼠AR 行為學癥狀明顯緩解（P＜0.01），鼻黏膜組織上皮細胞排列基本規則，纖毛上皮基本未出現脫落現象，這說明炎癥小體活化抑制劑可有效緩解海水吸入破壞鼻黏膜組織，緩解其造成的AR 更易誘發現象。

表1 對照組、SW-AR 組、抑制劑組小鼠AR 行為學特征（）

表1 對照組、SW-AR 組、抑制劑組小鼠AR 行為學特征（）

注：與對照組比較aP＜0.01；與SW-AR 組比較bP＜0.01。SW-AR為海水淹溺誘發過敏性鼻炎，AR 為過敏性鼻炎

噴嚏（次/10 min）2.60 ± 1.14 16.20 ± 3.03a 7.20 ± 1.92ab組別對照組SW-AR 組抑制劑組例數55 5撓鼻（次/10 min）5.00 ± 1.58 21.20 ± 3.83a 8.80 ± 1.92ab

2.2 小鼠鼻黏膜內細胞因子表達情況 結果顯示，與對照組比較，SW-AR 組小鼠鼻黏膜內常見細胞因子表達顯著升高（P＜0.01），提示其處于高敏的炎癥狀態。與SW-AR 組相比，抑制劑組小鼠鼻黏膜組織內細胞因子IL-6、IL-1β、IL-18 的表達顯著降低（P＜0.01）。這提示炎癥小體活化抑制劑可有效減輕鼻黏膜組織局部炎癥反應。見表2。

表2 對照組、SW-AR 組、抑制劑組小鼠鼻黏膜內細胞因子IL-6、IL-1β、IL-18 mRNA 相對表達量（）

表2 對照組、SW-AR 組、抑制劑組小鼠鼻黏膜內細胞因子IL-6、IL-1β、IL-18 mRNA 相對表達量（）

注：與對照組比較aP＜0.01；與SW-AR 組比較bP＜0.01。SWAR 為海水淹溺誘發過敏性鼻炎，IL 為白細胞介素

IL-18組別例數IL-6IL-1β 1.004 ± 0.085 4.400 ± 0.224a 1.520 ± 0.246ab對照組SW-AR 組抑制劑組555 1.042 ± 0.201 6.002 ± 0.368a 2.848 ± 0.208ab 1.006 ± 0.148 7.596 ± 0.451a 2.164 ± 0.329ab

2.3 小鼠血清內IL-18 的蛋白水平比較 結果顯示，與對照組相比，SW-AR 組小鼠血清中IL-18 蛋白水平顯著升高（P＜0.01），既往研究提示AR 小鼠鼻黏膜內炎癥小體高度活化，可導致IL-18 分泌增多［5］，提示SW-AR 小鼠可能存在炎癥小體活化。與SW-AR 組相比，抑制劑組小鼠血清內IL-18 蛋白水平降低，差異有統計學意義（P＜0.01），這一結果提示鼻黏膜局部使用炎癥小體活化抑制劑可有效抑制炎癥小體活化。見表3。

表3 對照組、SW-AR 組、抑制劑組小鼠血清內IL-18 蛋白表達水平（）

表3 對照組、SW-AR 組、抑制劑組小鼠血清內IL-18 蛋白表達水平（）

注：與對照組比較aP＜0.01；與SW-AR 組比較bP＜0.05。SWAR 為海水淹溺誘發過敏性鼻炎，IL 為白細胞介素

IL-18 表達水平63.200 ± 5.762 446.600 ± 48.998a 137.000 ± 49.522ab組別對照組SW-AR 組抑制劑組例數555

2.4 小鼠鼻黏膜局部炎癥小體活化情況 結果顯示，與對照組比較，SW-AR 組小鼠鼻黏膜組織存在高度活化的炎癥小體及細胞焦亡（P＜0.01），這很有可能是海水淹溺更易誘發AR 的潛在機制。與SWAR 組比較，抑制劑組小鼠炎癥小體活化明顯減少（P＜0.01）。這提示鼻黏膜局部使用炎癥小體活化抑制劑可有效減輕海水吸入所導致的鼻腔局部炎癥小體活化。見圖2、表4。

圖2 Western blotting 電泳圖

表4 對照組、SW-AR 組、抑制劑組小鼠鼻黏膜組織內caspase-1 p20 和GSDMD 活化情況（）

表4 對照組、SW-AR 組、抑制劑組小鼠鼻黏膜組織內caspase-1 p20 和GSDMD 活化情況（）

注：與對照組比較aP＜0.05，bP＜0.01；與SW-AR 組比較cP＜0.01。SW-AR 為海水淹溺誘發過敏性鼻炎

GSDMD-N/β-actin組別例數caspase-1 p20/β-actin 0.341 ± 0.049 1.338 ± 0.152b 0.573 ± 0.142 bc對照組SW-AR 組抑制劑組555 0.202 ± 0.039 1.049 ± 0.115b 0.287 ± 0.062ac

3 討論

既往研究多關注于海水淹溺誘導的急性肺損傷及其激發的急性呼吸窘迫綜合征（ARDS），常常忽略了其后發生的慢性炎癥反應疾病，如海水淹溺導致大量鹽類高滲溶液侵入鼻黏膜組織，造成局部組織缺氧、出血和炎癥損傷，進而使患者更易誘發AR 癥狀［3,8］。慢性炎癥疾病在發病初期往往容易被忽視，導致錯過最佳治療時間，長期慢性炎癥可發展為過敏性哮喘或鼻竇炎［4,8-10］，嚴重時會影響官兵的戰斗力。筆者利用小鼠SW-AR 模型，通過觀察小鼠行為學特征、鼻黏膜組織切片，明確海水淹溺可導致小鼠更易誘發典型的AR 癥狀。這一模型的成功構建為SW-AR 發病機制和相應治療提供了重要支撐。

本研究探討了SW-AR 小鼠的行為學表現和炎癥反應水平，而對于其中浸潤的免疫細胞的活化情況和亞群尚未進一步鑒定，例如通過流式檢測組織和血清內Th2 細胞、天然免疫淋巴細胞（ILC2）、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞和肥大細胞的數量和活化情況（重要細胞因子分泌水平）、鼻黏膜中嗜酸性粒細胞和中性粒細胞發生胞外陷阱的情況［11-12］、肺神經分泌細胞（PNEC）分泌神經遞質的改變等［13］。因此，通過對SW-AR 小鼠鼻黏膜中免疫細胞的測定，可進一步解析明確其鼻黏膜局部炎癥反應發生的潛在機制。

NOD 樣受體家族介導的炎癥小體活化及其放大環路是天然免疫應答的重要環節，參與了多種外源性微生物感染、神經退行性疾病、糖尿病、腫瘤等疾病的進展過程［14］。本課題組前期研究發現NOD 樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NLRP3）炎癥小體活化及其誘導的鼻黏膜細胞過度焦亡在OVA 誘導的AR 的發生發展過程中發揮重要作用［5］。本研究進一步拓展分析了炎癥小體活化參與AR 的功能，證實其亦可能參與SW-AR 的發病過程。目前已知的人NOD 樣受體家族受體包含22 個分子，根據其N 端不同效應結構域可分為4 個亞家族［15］，除了NLRP3外，其他NOD 樣家族分子是否可能參與SW-AR 疾病的發展過程，識別DNA 活化的AIM2 炎癥小體是否也在SW-AR 中發揮調控作用，都是值得進一步研究和闡明的方向。

基于上述炎癥小體活化及其放大炎癥環路參與SW-AR 的疾病進展過程，筆者使用炎癥小體活化的特異性抑制劑治療SW-AR 小鼠。本研究發現，在海水淹溺后給予炎癥小體抑制劑治療，可有效緩解SW-AR 癥狀，這一結果提示炎癥小體很可能成為SW-AR 臨床治療的新靶點，也為免疫調節治療SW-AR 的研究提出了新的方向。